a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验教案--

实验三 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

一、实验目的

1.制备固定化的淀粉酶。

2.进行淀粉水解的测定。

二、实验原理

用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。

这里使用的是枯草杆菌的a-淀粉酶，其作用的最适pH范围为5.5-7.5，最是温度为50-75℃。

1、酶的固定化

酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。

固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。

吸附法：

P32利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

2.石英砂的吸附作用

石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理吸附在一定程度上是可逆的。

3.淀粉酶催化反应

淀粉酶：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷键的酶之总称。

淀粉酶包括α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和葡萄糖苷转移酶、环状糊精葡萄糖苷转移酶等。

α—淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开α—1．4糖苷键(水解中间的α—1．4键比分子末端的α—1．4键概率大)，遇到分支点的α—1．6键不能切，但能跨越分支点而切开内部的α—1．4糖苷键，由于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈α—构型(光学)，故称这种酶为α—淀粉酶。

α—淀粉酶的水解反应：淀粉在α—淀粉酶的作用下很快被切割成分子较小的糊精、低聚糖、麦芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，对碘呈色反应为篮－紫－红－无色，又叫液化酶。

糊精:分子式为(C6H10O5)n?H2O，为白色或类白色的无定形粉末；无臭，味微甜。在沸水中易溶，在乙醇或乙醚中不溶。

4.淀粉的水解

α-淀粉酶 β淀粉酶糖化淀粉酶

淀粉糊精麦芽糖葡萄糖

遇碘显蓝色遇碘显红色

淀粉遇碘显色原理：淀粉、糊精等与碘结合为淀粉/糊精-碘包合物显色。分子结构不同，结合方式不同，颜色不同。

三、实验对象

高中生。（本实验来自浙版高中生物选修一）

四、实验材料和器械

材料：a-淀粉酶、石英砂、淀粉/KI-I₂溶液、蒸馏水。

器械: 层析柱、滤布、烧杯、指形管、量筒、胶头滴管、玻璃棒、电子天平。

五、实验步骤

1、配制可溶性淀粉溶液。用电子天平称取25mg可溶性淀粉溶于50ml沸水（可溶性淀粉先用冷水调成糊状，再加入沸水中至50ml）。将配制好的淀粉溶液放置在60℃的水浴锅中备用。（注意：此数据为一组实验的用量，若配全班用量乘以实验小组数即可，可由授课教师配制全班用量以节省时间。）【方案改进：淀粉溶液在70℃水浴锅中保温，且在水浴锅中已为学生准备好用100ml烧杯装的配制好的淀粉溶液，注意嘱咐学生要在用层析柱反应时才拿出来，勿提前拿；而之前检测石英砂固定a-淀粉酶的上清液所用淀粉于水浴锅中大烧杯中取，避免小烧杯中淀粉溶液取出来之后温度降低致使反应结果不佳。】

2、α—淀粉酶的固定化。在50ml烧杯中将电子天平称取的5mg a-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中，由于酶不纯，可能有些不溶物，再加入电子天平称取的5g石英砂，不时搅拌，固定化15分钟。（注意：搅拌时用力不可太猛及搅拌时间不易过长，以免石英砂被磨细穿过滤布带入到流出液中，搅拌的速度应是缓慢的，搅拌时间过长也不易酶的固定，这里授课老师可以做示范动作让学生来体会。）【方案改进：由于实验时间不足的问题，前两个步骤由教师准备。】

3、检测未吸附的游离淀粉酶是否洗涤干净。小心倒掉上清液后，（每次）用10-15ml的蒸馏水小心清洗石英砂2-3次，每次取其上清液0.5ml于试管中，同时滴加淀粉溶液充分混匀。再加入1-2滴KI-I2 溶液，若溶液变为蓝色，说明中已无游离a-淀粉酶，如果溶液为红色，继续用蒸馏水清洗，直至淀粉溶液变为蓝色为止。

4、先把滤布放入固定化酶装柱中，再装入固定有a-淀粉酶的石英砂约4ml，装柱过程中可在装有石英砂的烧杯中加入少量蒸馏水，便于石英砂流入层析柱，同时适当打开层析柱的调节装置，使多余的液体可以流出。（加入少量蒸馏水的目的是让固定好a-淀粉酶的石英砂尽量全部装进柱中，装柱时应尽量使石英砂的表面平整，这样可以使淀粉溶液充分与酶反应。流出的液体主要是加入的蒸馏水）

5、将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上，用滴管加淀粉溶液后，调节层析柱的调节装置使淀粉溶液约以0.3ml/min(6滴/min)的流速过柱，在流出1-2ml反应液后（让塑料管中的水流出），转动关闭层析柱的调节装置，放置5min（让淀粉液与酶充分反应）。

6、打开调节装置，0.3ml/min(6滴/min)的流速过柱，在流出1-2ml反应液后（1-2ml液为：装柱下面塑料管中未充分反应的淀粉液），用两支试管分别接收约0.5ml流出液（10滴，20滴为1ml），按以下表格在试管中加入相应试剂，观察结果。

六、实验结果与分析

流出液+碘液：1.变红，有糊精生成。若为浅红，则说明糊精含量少，淀粉中支链淀粉含量少。支链淀粉被α—淀粉酶催化生成糊精。

2.变蓝，①流速过快，淀粉流出。②保温效果差，反应时淀粉温度降低过多。

3.浅黄，碘液的颜色，没有糊精生成，也没有淀粉流出。由于淀粉反应后的产物不止一种，而且支链淀粉含量少，故生成糊精量少，反应后用碘液检测时红色不明显，或者由于酶不纯，不仅有α—淀粉酶，还有β淀粉酶，糊精又被β淀粉酶反应成麦芽糖，麦芽糖遇碘不显色。

4.紫色：有糊精生成，也有淀粉未反应而流出。①温度降低过快，酶活力低。②流速过快，淀粉为反应充分而流出。

七、注意事项

1、α—淀粉酶的固定化过程中，用力不易过猛，搅拌时间不易过长。

2、加固定好酶的石英砂入层析柱时，勿先加液体，应直接用玻璃棒将石英砂弄入层析柱，动作轻柔，将石英砂填平、填实。

3、在层析柱中加入溶液不要过快，防止石英砂表面不平整。

4.要在用层析柱反应时才将淀粉溶液从水浴锅中拿出来，勿提前拿，否则在室温下温度降低过快；而之前检测石英砂固定α-淀粉酶的上清液所用淀粉于水浴锅中大烧杯中取，避免小烧杯中淀粉溶液取出来之后温度降低致使反应结果不佳。

5.滴速不能过快，使其充分反应。

八、具体实验讲解

同学们，开始上课，我们今天要做的实验，是α—淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测。那什么是固定化酶呢？请大家把书翻到书P30，看到原理第二段，我请一位同学起来读一下：固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

好，我们了解了固定化酶的概念，那固定化酶有哪些优点呢？大家来看一下资料。

我们要做的实验是α—淀粉酶的固定化，那……为什么要选用α—淀粉酶呢？

①水溶性酶②它的反应物和产物都容易被检测③便宜易寻

今天我们要用的固定方法是吸附法，什么是吸附法呢？

请大家往后翻一页，翻到P32，看到资料搜索1，我请一位同学来读一下第一段：利用吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定的方法，通常有物理吸附和离子吸附。

好，吸附法通常有物理吸附和离子吸附，简单地说，物理吸附就是利用范德华力进行吸附，而离子吸附则是利用的离子正负电荷相吸的原理。当然，方法不止一种，具体的请大家自己课后查一下。

刚才同学们说到，固定化酶就是将水溶性的酶用某种方法固定在某种介质上，那用什么介质来固定？好，石英砂在这里就闪亮登场了，为什么采用石英砂呢？它的吸附原理是怎样的？首先，大家来看一下原理，它是通过分子间的范德华力，与α—淀粉酶很好的结合吸附，石英砂在这儿采用的就是物理吸附。同时它具有良好的惰性，不与底物、产物发生反应。

好，α—淀粉酶、石英砂有了，具体怎么固定呢？我们就开始做实验了。

首先，在50ml烧杯中将5mg α—淀粉酶溶于4ml蒸馏水中，如果有不溶物，大家不要担心，这是由于酶不纯所引起的，属于正常现象。接下来，再加入5g石英砂，不时地轻轻搅拌，固定化15分钟。注意，搅拌时用力不可太猛，时间不能过长，以免石英砂被磨细影响后续实验，由于固定需要15分钟，时间过长，所以这一步骤我们已为大家准备好。

固定好之后就可以装柱了，大家看这个层析柱，下面有一个小孔，我们可不可以直接将石英砂倒进去啊？石英砂会漏下去对不对？那我们就将一块滤布塞入柱中，用玻璃棒沾一点杯子中的水，把滤纸润湿，让滤纸贴在层析柱中，接下来就可以将石英砂转移进柱中，用蒸馏水辅助，将杯子中剩下的石英砂尽量全部转移进层析柱中，同时要打开层析柱下方的调节装置，使多余的液体流出。这里同学们要注意了，装柱时应尽量使石英砂的表面平整，填实一些，这样可以使淀粉溶液充分与酶反应。

好了，装完柱之后我想问大家一个问题，是不是所有的a-淀粉酶都被固定在石英砂上了呢？那游离的α—淀粉酶应该怎么处理呢？洗到什么程度，又如何检测呢？请大家结合淀粉水解原理讨论一下。

α-淀粉酶 β淀粉酶糖化淀粉酶

淀粉糊精麦芽糖葡萄糖

遇碘显蓝色遇碘显红色

我们小心倒掉上清液后，（每次）用10-15ml的蒸馏水小心清洗石英砂2-3次，每次取其上清液0.5ml于试管中，同时滴加淀粉溶液充分混匀。再加入1-2滴KI-I2 溶液，若溶液变为蓝色，说明中已无游离α—淀粉酶，如果溶液为红色，继续用蒸馏水清洗，直至淀粉溶液变为蓝色为止。在这儿呢，我们已经为大家配好了0.5mg/ml的淀粉溶液，在70℃水浴锅中恒温保存，一会儿大家洗涤游离酶的时候可以直接去取。

我们排除了游离酶的干扰，但是，我们能确定石英砂上真正有固定了的α-淀粉酶吗？我们肉眼看不到，那这是我们应该怎么办？可以利用淀粉水解原理来检测。

将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上，用滴管加淀粉溶液后，调节层析柱的调节装置使淀粉溶液约以0.3ml/min(10s一滴)的流速过柱，在流出1-2ml反应液后（让塑料管中的水流出），转动关闭层析柱的调节装置，放置5min（让淀粉液充分与酶反应）。

打开调节装置，0.3ml/min(10s一滴)的流速过柱，在流出1-2ml反应液后（1-2ml液为：装柱下面塑料管中未充分反应的淀粉液），用两支试管分别接收约0.5ml流出液（10滴，20滴为1ml），按以下表格在试管中加入相应试剂，观察其颜色变化。

我再为大家理一下实验步骤，淀粉溶液我们已经为大家配好，固定15分钟也已准备好，同学们要做的就是将游离酶洗去，然后装柱，最后用淀粉溶液进行检测。大家还有没有什么疑问？

好，那就开始做实验吧！

附：板书

……

第二篇：糖化酶固定化实验报告

糖化酶固定化实验报告

学号： 080500130

姓名：黄兆峰

专业：微生物工程

其他组员：黄志成、李盟、苏温培

指导老师：朱秋享

实验时间： 2008.11.5—2008.11.7

一、目的要求

本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。

二、基本原理

游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。

酶活测定原理：糖化酶（即淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

本次固定化酶使用的方法是包埋法，将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法成为包埋法。包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法为凝胶包埋法。本次实验中具体使用的方法为海藻酸钙凝胶包埋法。

三、实验仪器及材料

1、实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器

2、糖化酶、海藻酸钠、明胶

四、试剂配方

1、2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉碎2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml，此溶液需当天配制。

2、1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液

取无水醋酸钠8.024g，先在少量水中溶解，定容至1000ml。取分析纯冰醋酸5.78ml定容至1000ml。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求的缓冲液。

3、0.05 mol/L碘液：

称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中。

4、0.1 mol/L氢氧化钠溶液：

称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5、1 mol/L硫酸：

吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6、0.1 mol/L硫代硫酸钠：

称取26克硫代硫酸钠和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。

五、实验步骤

1、酶活测定

⑴ 操作步骤

取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)准确计时1小时。取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入 2N硫酸 2毫升。用 0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。

⑵ 计算

酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2/V3 *2

A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；

B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；

90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；

V1—反应液总体积(32.20毫升)；

V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；

V3-吸取酶液毫升数(2毫升)；

2—反应30min,换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数；

N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。

2、米氏常数的测定

取1ml游离酶，分别以0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，1.00%，2.00%浓度的可溶性溶液为底物，在40℃下反应10min，采用以上的方法测定游离酶活，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，即以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标。其斜率即为米氏常数。

3、糖化酶的固定化

将酶液15ml游离酶与3%的海藻酸钠150ml混合，然后加入3%的明胶溶液150ml混合乳化约10min，调pH为4，慢速搅拌并降温至5～10℃，通过6号注射针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4℃，球在氯化钙溶液中被硬化30min，固定化酶被贮存在0～5℃冰箱。

4、固定化酶的酶活测定

⑴ 操作步骤

取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入固定化酶5g(空白以蒸馏水代替固定化酶)准确计时1小时。取出过滤终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入 2N硫酸 2毫升。用 0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。

⑵ 计算

酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2

A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；

B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；

90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；

V1—反应液总体积(32.20毫升)；

V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；

N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。

5、固定化酶活力回收测定

固定化酶活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力X100%

6、固定化酶半衰期测定

六、实验数据与数据处理