生化实验报告

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实验1.多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、实验原理与目的

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形

成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、实验材料与试剂

1.材料：马铃薯（大约每小组100-200g）

2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml； NaCl； 聚乙二醇： DEAE－纤维素 DE52； 葡聚糖凝胶Sephadex G-200:

三、 实验步骤

（1）粗酶提取： 马铃薯丁按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。

四、实验结果

1.实验所得的初提酶液颜色为米黄色，较其他组的颜色浅。主要是本组实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少；从而最大程度的保留了PPO的活性。

2.经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体。为进一步的柱层析提供了优良材料。

五、讨论与结论

1.本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化。

2.离心管的内盖一定要盖严，否则在离心过程中会洒出来对离心机造成损害，离心之前一定要仔细检查盖子是否合适。

3．加入硫酸铵固体时一定要注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果。

实验2 胰酶的分离提取

一、原理与目的

提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸胺分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸胺饱和度下被沉淀而除去。经多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在PH3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此PH酶易变性；高于PH5.0时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低PH和低温下进行。

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

二、材料与试剂

1.材料：新鲜猪胰脏

2.试剂：PH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2MNaOH溶液、5MNaOH溶液、0.1MHCl溶液、0.025M HCl溶液、0.01M HCl溶液、0.4M PH9.0硼酸缓冲液。

三、操作步骤

称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，粉碎胰脏。 加100m巳预冷却的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取， 检查提取液中PH，若高于pH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持在PH2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18—24h，4层纱布过滤，取滤液50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1一2h) 合并滤液，用5MH2PO4溶液调正pH至2.5-3.0。 放置3—5h后，，取上清，量其总体积。

盐析：加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度盐析1hr， 12000rpm 离心 10min。上清液加硫酸铵，至75％饱和度 盐析1hr， 12000rpm 离心 10min。沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1 MTris，透析过夜，4 ℃保存。

四、结果与分析

1. 经过以上实验步骤得到澄清的酶液。

2. 用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。

3. 提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，胰酶在PH3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此PH酶易变性；高于PH5.0时，酶易自溶而失活。

实验3 卵清蛋白的分离提取

一、实验原理

鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定。

由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。

二、实验材料与试剂

1.材料：新鲜鸡蛋2只

2.试剂：10％ TCA（用固体NaOH调pH至1.05～1.10，需要50 ml。）；5 N HCL；5 N NaOH；冷丙酮；胰蛋白酶液；BAEE－0.05 M；pH 8.0 Tris－HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22 mg CaCl2，50 ml。）；pH 8.0，0.1 M Tris－HCL缓冲液。

三、操作步骤

（1）新鲜鸡蛋两只，取蛋清50 ml，温水浴25℃～30℃，加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），最终pH约3.5。再继续搅拌30 min，4℃放置过夜 。

（2）次日用布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液。加入4℃预冷的丙酮200 ml，在4℃放置2 h之后，弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min，收集沉淀。沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜。10000 rpm离心10 min,取上清液，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜。

（3）第三天，10000 rpm离心10 min,取上清液。

四、实验结果与分析

1.经过以上实验步骤得到了较为纯净的鸡卵粘蛋白，呈白色粉末状。

2.在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。

3.在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。

4.透析后若袋中有沉淀，则要再次离心出去沉淀。

实验4 柱层析纯化PPO

一、实验原理

柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白的手段。在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。

（一）离子交换层析：离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有可解离的基团，在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子其交换作用。当一定量的溶液通过交换柱时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，全部被交换并吸附在树脂上。交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至完全把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。蛋白质的离子交换过程包括吸附和解吸附两个阶段。吸附在离子交换剂上的蛋白质通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离，或者通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。

（二）凝胶色谱层析：其分离纯化蛋白质的原理是分子筛效应：样品溶液流经凝胶色谱柱时进行垂直向下的移动和无定向的扩散运动。再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子物质直径大、不易进入凝胶颗粒的微孔，只能分布在颗粒之间，洗脱时向下移动的速度较快；小分子物质在凝胶颗粒间隙中扩散的同时进入凝胶颗粒微孔，向下移动时，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后在进入另一凝胶颗粒，下移伴随扩散，因此小分子物质的下移速度落后于大分子物质。

二、实验试剂

0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml；葡聚糖凝胶Sephadex G-200等。NaCl；聚乙二醇；DEAE－纤维素 DE—52。

三、操作步骤

（一）1. DEAE－纤维素的处理及装柱

（1）处理：本实验采用的是DEAE－纤维素 DE —52弱碱型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE —52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的Hcl溶液中浸泡1—2h，用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH4以上，并将其在抽滤斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的HCl溶液中浸泡1—2h，再用无离子水或蒸馏水洗至中性。

（2）装柱：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层

析柱的平衡。

（3）平衡：在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5－1 ml/ min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE—52柱进行平衡。

2.上样：将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。

3.洗脱：用含有0.2-0.6MnaCl的0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）进行梯度洗脱。

4.收集PPO活性部分洗脱液，测定酶活性和蛋白浓度。

（二）1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡

（1）柱材处理：称取一定量的Sephadex G－200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48 h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。

（2）装柱：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。

（3）平衡：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。在本实验中用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）平衡Sephadex G－200凝胶。

2.上样：将浓缩酶液上柱（含蛋白不超过4%，但不能太低）。

3.洗脱：用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

4. 测定酶活性和蛋白浓度

四、结果与分析

（一）在上一步凝胶层析纯化后挑选的蛋白含量和酶活最高的一管收集液进

从OD值的大小，可以得知粗提液的蛋白含量是最高的。其他几个不同时间段所接收的洗液第6号试管的蛋白含量最高。第5管酶活性最大，蛋白含量第5管也不低，可以认为第5管就是多酚氧化酶最集中的一管。

（二）凝胶色谱层析纯化后PPO中的蛋白含量与酶活性如下表所示：

从OD值的大小可以得知第2管的蛋白含量是最高的。粗酶的含量是0.023，明显比第2管低，可见层析后对酶有浓缩的作用。可以认为第2管就是最集中PPO最集中的一管。

五、结论与讨论

1. 上样时要控制好速度，不可使胶干了。

2. 反应时加入酶标板后要充分混合。

3. 上样前一定要先平衡层析柱，保证样品在层析柱内时所处的pH及离子强度环境一致减少样品的分解变性。

4. 上样之后就要立即接收洗液。

5. 测定酶活时加入底物后要静置一段时间让底物充分反应后再测。这样测出来的结果才比较准确。

实验5 酶含量和活性测定

1、考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度

一、实验原理与目的

生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质测定方法有紫外吸收法，双缩脲法和Lawry法等。另一种方法是蛋白质－染料结合法，即考马斯亮蓝G－250法。此方法试剂简单、经济。测定简便快速。具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其他物质的干扰很小，可采用对照来消除。

考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度的基本原理是：当考马斯亮蓝G－250染料与蛋白质结合时，其存在两种不同颜色（红色与蓝色），红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465 nm移动到595 nm，染料与蛋白质的结合与595 nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线性相关，其蛋白结合反应在2－3 min内即可完成，而反应生成的复合物在1 h内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白测得O.D595值绘制标准曲线，即可求得待测样品的蛋白质浓度。

二、材料与试剂

1.材料：经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE－纤维素DE 52分离的酶液和Sephadex G－200分离纯化的酶液样品。

2.试剂：（1）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂：

称取100 mg考马斯亮蓝G－250溶于50 ml 90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100 ml，最后加无离子水或蒸馏水定溶到1000 ml，此溶液可在常温下放置一个月。

2 、 PPO活性测定

一、实验原理

PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷

酸氢二钠—0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

二、实验材料与试剂

1.材料：多酚氧化酶粗酶液、硫酸铵沉淀组份、DE—52洗脱组份、葡聚糖凝胶洗脱组份

2.试剂：0.01M邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠—0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8

三、操作步骤

在含有4ml pH5.8的0.2M磷酸氢二钠—0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml、浓度为0.05M的邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5min，在分光光度计410nm处读取吸光值。

实验6 .亲和层析纯化胰酶

一、实验原理

在制备胰蛋白酶过程中，往往混杂着与胰蛋白酶相近的蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。由于三者在物理化学性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们彼此彻底分开。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层析技术进一步纯化后、可达到十分满意的效果。

亲和层析作为一种新型的分离纯化技术，可以用来纯化各种酶、抗体、抗原、维生素结合、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸以及其他生物大分子化合物。与一般的提纯生物大分子化合物的方法相比，亲和层析具有简单、快速、得率和纯化倍数高等显著特点，尤其适合实验室规模的微量生物大分子化合物的分离纯化。但是，亲和层析也有其局限性。由于某一种生物大分子化合物只与特定的配基之间具有亲和力，因此针对每一个分离对象不仅需要寻找和制备专一的固相配基，而且还需要选择特定的层析条件。几乎没有统一的方法可供任意配套。 卵类粘蛋白在pH 7～8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH 2～3时又能解离，因而掌握好上柱的pH条件和洗脱缓冲液条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白的粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合的杂蛋白后，改变pH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化的目的。由于亲和层析结合的专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。本实验将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sepharose—G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本技术和过程

二、实验材料与试剂

1.材料：粗胰蛋白酶、鸡卵粘蛋白、Sepharose—G75

2.试剂：

0.05M NaIO4溶液、5% K2CO3、0.27gKBH4、0.1M Tris-HCl pH7.5(含0.5M KCl，

0.05M CaCl2)、0.1N 甲酸钾-0.5M KCl pH2.5

三、操作步骤

1. Sepharose—G75的活化及偶联

将2.5g干重的葡聚糖凝胶Sepharose—G75溶胀洗涤数次、缓慢搅拌，加入0.05M NaIO4溶液50ml，静置30min后，蒸馏水洗涤数次，抽干备用。接着，将

纯化的鸡卵粘蛋白溶于水中，加入已经活化好的葡聚糖凝胶。用5% K2CO3调节溶

液pH至7.5-9.0，缓慢搅拌3h。在此过程中一定要保持pH的稳定。将0.27gKBH4溶于20ml水中，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5之间，洗涤数次备用。

2.亲和层析

将鸡卵粘蛋白—SepharoseG75 装柱（1×10 cm）,用pH7.5, 0.1 M含0.5 M KCl，0.05 M CaCl2的缓冲液平衡，平衡约2～3倍的柱体积。将粗胰酶液上样柱

层析。用紫外蛋白监测仪280 nm处监测蛋白吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH 7.5的平衡缓冲液洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1 N的甲酸钾0.5 M KCl，pH 2.5的洗脱液解吸，柱的流速维持在1.5 ml /min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，则总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。

当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。

胰蛋白和活性测定见实验2

四、结果分析

五、结论与讨论

1.如果是洗脱的时间不够，或者是洗脱液的离子浓度不够大，不能将蛋白质洗脱下来。

2在上样品时可以多上一些，若柱子装不下，可以将下端出液口打开，放出部分液体，待到检测仪的读数有大的变化时收集洗液。

3.层析柱一定要平衡好后才能使用，否则实验结果会很不准确。

4.检测仪使用前一定要调零，还要使用正确的档位。

实验9 染色体DNA的提取

一、实验目的与原理

DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。本实验通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。通过实验学习和掌握提取植物染色体DNA的原理和方法。

二、材料与试剂

1.材料：大肠杆菌

2.试剂:

细胞裂解液 ， 100mM Tris-HCl ，5mM EDTA ， 500mM NaCl， 1.25% SDS pH 7.5，饱和酚， 氯仿/异戊醇 ， 酚/氯仿/异戊醇 ，70%及无水乙醇， 3M NaAC， 50×TAE缓冲液 ，电泳载样缓冲液，无菌水

三、操作步骤:

培养好的菌液1.0 mL， 离心收集菌体。600ul 65℃ 预热的细胞裂解液，悬浮菌体。加入60ul 酚滚动混匀，65℃，30min。加入600ul氯仿混匀，静置4～5min，离心。取上清。等体积氯仿抽提一次。0.1V 3M NaAc（Ph5.2）、2V乙醇，－70℃20 min沉淀DNA。70％酒精洗涤沉淀DNA，真空干燥。沉淀溶于40-100μL无菌水。

四、结果与分析

将所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳从而分析提取样品纯度，电泳结果如下：

我们是19组，从电泳结果可以看出本次提取的基因组DNA基本没有降解。

五、实验中应注意事项：

1.加入裂解液后使菌体与裂解液充分接触，充分裂解。

2.取上清液时应该遵守宁可少得上清，也不要将下层取出的原则。

3.提取DNA时动作要轻，不能搅拌，应滚动混匀或是颠倒混匀。

实验10. 质粒DNA的提取与纯化

一、实验原理与目的

①细菌培养物的生长：pUC系列等标准选择压力LB培养基中生长到对数晚期（菌不能老）pBR322对数生长期加入氯霉素继续培养2小时

②细菌的收获和裂解：碱变性抽提的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

③质粒DNA纯化：乙醇或异丙醇 乙醇＋NaCA，低温共沉淀 异丙醇室温沉淀 纯化－－－氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心

④质粒DNA保存：用RNase来去除溶液中的RNA，再用SDS与KAC处理后，质粒DNA溶于TE溶液中低温保存。因加入的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须将其除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白质复合物沉淀，再加入KAC使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。

二、材料与试剂

1.材料：大肠杆菌

2.试剂

Solution Ⅰ ： 50mM 葡萄糖 ，25mM Tris-HCl(pH 8.0)， 10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌，4℃保存

Solution Ⅱ ：0.2M NaOH, 1% SDS,现配现用

Solution Ⅲ ：5N KAC pH 4.8,高压灭菌，4℃保存

3M NaAC ，pH 5.2 高压灭菌，4℃保存, 氨苄青霉素 25mg/ml,溶菌酶 8mg/ml, 氯仿/酚, 异丙醇, LB培养基, 电泳试剂

三、操作步骤:

含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜，吸取1.5ml＋

1.5ml。

离心，5000rpm,1－2min 沉淀。加入预冷的100ul Solution Ⅰ,充分振荡悬浮。加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min, 加入150ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min。离心,12000rpm,,5min。 取上清.氯仿一次，离心 12000g 2min

上清+0.1V 3M NaAc（Ph5.2）、2V乙醇，－70℃20 min沉淀DNA。70％酒精洗涤沉淀DNA，真空干燥。沉淀溶于40-100μL无菌水

四、结果与分析

将所提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测提取质量，电泳结果如下：

从电泳结果可以看出所提质粒DNA基本没有降解，没有弥散带。

五、实验结果分析

1.该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。去掉染色体关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液III,同样处理。

2．乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。

3．抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA。

六、实验注意事项

1、培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌，经储藏的培养菌不能直接进行质粒提取制备

2、试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解

3、试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。

4、试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。

5、有的质粒应在37℃,220rpm下,生长16-18小时 或加入MgCL2

实验11. 亚克隆技术

一、实验目的与原理

限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。本部分实验主要通过EcoRⅠ，Hind Ⅲ两种限制性内切酶对λDNA的双酶切及部分酶切操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术。

二、材料与试剂

1.材料：λDNA

2.试剂： EcoRⅠ及缓冲液 ，Hind Ⅲ及缓冲液，λDNA 0.532μg/μl，TAE缓冲液

三、操作步骤

1.取3支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入(体系均为20μl)

2.37℃保温1-2小时，保温结束后，加入0.5M(pH 7.2)EDTA(使终浓度达到10mM)，加入6μl电泳加样缓冲液，电泳分析。

四、结果与分析

酶切后分别对基因组DNA、质粒DNA以及λDNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如下（从左至右依次为基因组DNA、质粒DNA以及λDNA的酶切结果）：

五、实验中应注意问题 我们是19组，电泳结果不好，第五组的酶切做得比较好，以示对比。

1. 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。

2.待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

3.想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。

实验12 DNA片断的连接技术

一、实验目的与原理

DNA酶切片段的连接是两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一DNA片段的连接技术。

二、试剂：T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液， 200mM Tris-HCL (pH 7.6)，50mM MgCl2，50mM DTT，500μg/ml ／牛血清白蛋白，5mM ATP，λDNA，酚/氯仿，酚 ，TE缓冲液，电泳缓冲液，3M NaAC 三、操作步骤

取1支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入(体系为10μl)。16℃过夜。提取已联接好的DNA片段，电泳分析。 四、实验注意事项

1. 10x Ligation Buffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。

2.T4 DNA Ligase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。

3.插入片断和载体片断的比例要高。 4.反应体系10μl，不要太大。 5.插入片断和载体片断要酶切良好。

实验13 . 受体菌感受态细胞的制备

一、实验目的与原理

当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一重要的技术关节。本实验拟通过这方面的操作，让学员了解和掌握感受态细胞的制备过程。

二、材料与试剂

1.材料：大肠杆菌

2.试剂： LB培养基、0.1N CaCl2、0.1M MgCl2、3mM 氯化6氨合高钴

TFB: 10mM MES (pH 6.3)，45mM MnCl2， 10mM CaCl2， 100mM KCl

三、操作步骤

1.大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基中摇瓶培养大肠杆菌到对数期。

2.取1ml培养物7000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置。

3.用预冷的氯化镁悬浮菌体，7000rpm离心3min.收集菌体，冰浴放置。

4.用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min，7000rpm离心3min收集菌体，冰浴放置。

5.加入200μl预冷氯化钙(或TFB)，放置于冰浴，即得感受态细胞。

四、实验结果与分析

获得了良好的大肠杆菌感受态细胞。感受态细胞制备及转化中的影响因素：

1. 细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。密度过高或不足均会使转化率下降。

2. 质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。

3. 试剂的质量：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，

最好分装保存于4℃。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

5. 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

实验14 重组片断的转化、克隆及筛选

一、实验目的与原理

转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒导入受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定的复制和表达。本实验即通过相关技术的操作，让学生掌握转化技术。

二、材料与方法

1.材料：感受态大肠杆菌细胞

2.试剂

LB培养基, 0.1N CaCl2,

三、操作步骤

1.现制感受态细胞可直接使用，加入溶于TE的待转化外源DNA，冰浴30min。

2.43℃热冲击30秒，加入1mlLB液体培养基，37℃保温30分钟－2小时。

3.7000rpm,离心3min.收集菌体，用0.4mlLB液体培养基悬浮。

4.取0.2ml菌悬浮液，涂布于有选择压力的LB培养基上，37℃保温过夜。

四、实验结果及分析

1. 次日取出培养基观察到有大量的白色小圆白斑分布于培养基上，同时也有蓝色的斑点。可见转化是成功的，白色的小斑点就是装入了重组质粒的细菌所产生的菌落。

2. 同时有蓝色的斑点出现，说明抑制物质的量太少，还不能抑制未不含重组质粒的细胞生长。建议下次实验加大抑菌物质的量。

3. 在转入培养基培养时，培养皿一定要倒扣，保证菌的生长湿度。

4. 热激转化的成本较低且效果较好。

实验7. SDS—PAGE分离测定蛋白质、酶

一、实验目的与原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。19xx年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，而与所带电荷无关，在一定条件下，蛋白质分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及其分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、实验材料与试剂

1.材料：

硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品； DEAE－纤维素 DE 52 柱层析的样品；Sephadex G－100柱层析的样品。

2.试剂：

（1）丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液：30g Acr,668mg Bis,加水至100 ml。

（2）10％的SDS溶液

（3）10％的过硫酸铵溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分离胶缓冲液：将18.15 g Tris溶解后，加5 ml 6 N HCL溶液，定容

至100 ml，pH 8.8。

（6）浓缩胶缓冲液：6 g Tris溶解后，加10 ml 6 N HCL溶液定容至100 ml，

pH 6.8。

（7）电极缓冲液：6 g Tris,28.8 g甘氨酸和1 g SDS，加水溶解定容至1000

ml，pH 8.3。

（8）样品缓冲液：1 g SDS，2 ml 巯基乙醇，5 ml甘油，1 ml 0.1％的溴酚

蓝，1 ml上层胶缓冲液，定容至50 ml。

（9）染色液：0.25 g 考马斯亮蓝250，溶于含有45％的甲醇，10％的冰醋酸

的水溶液中。

（10）脱色液：7.5％的冰醋酸和10％的甲醇水溶液。

（11）已知分子量的标准蛋白。

三、实验步骤

1.凝胶制备：

用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（注意不能漏胶），垂直放置。将下表列出的的配方，配成分离胶溶液，立即倒入垂直槽，并慢慢加入无离子水，将凝胶液面压平，20 min后凝聚。倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒人按表配成的浓缩胶，再插入梳子。

2.点样：

分别取样品若干毫升于离心管中，按1：1～1：5的比例加入5×样品缓冲

液，在沸水浴中加热3—5 min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30μl不同浓度的标准蛋白样品和实验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流升到10 mA，当溴酚蓝进入分离胶将电源加到15～20 mA（2～3 mA/em）,保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2 cm时，即可停止电泳。

3.染色：

电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，用脱色液，用脱色液脱掉剩余染料后，倒入脱色液第二天换一次脱色液，24 h后，即可看到清晰的蛋白质条带。

四、实验结果

PPO和胰酶经SDS—PAGE电泳后

由图可以看出，由于操作不当，结果不是很明显。

五、注意事项：

1．蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白时最好用去离子水，再加等量2×SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行Sephader G25过柱。

2．SDS的质量 由于变性蛋白是与SDS结合而带负电荷，蛋白结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同迁移率的电泳图谱。

3．上样孔是否平齐，若上样孔不平齐，也影响蛋白电泳的迁移率。

4．为防止相邻泳道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液。

实验8. Western bloting技术

一、实验目的与原理

Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的、灵敏的方法。该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白－一抗－二抗的位置即将呈现一定的颜色。

二、实验材料与试剂

1.材料：待检测蛋白

2.试剂：转移缓冲液：电极缓冲液加20%甲醇。封闭液：1% (W/V) 脱脂奶粉,溶于TBST中。

TBST：150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，0.01% antiform A，0.02%叠氮钠。

第二抗体稀释溶液：1% (W/V) 脱脂奶粉,溶于TBST中。

0.5% Tween 20

碱性磷酸酶酶显色液

三、实验步骤

1.SDS－PAGE电泳见实验4

2.电转：

(1) 剪6块3mm滤纸和一块NC膜；

(2)将剪好的3mm滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟；

(3)按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中,在塑料支架上放一块海绵

(4)将3块3mm滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另3块虑纸和海绵放上；

凝胶一面向负极；

(6) 接通电源电压40伏，电流0.17-0.2Ａ，转移1.5-6小时；

(7) 转移结束后，取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿作好标记，切下其中一个孔所对应膜的一半,用氨基黑或考马斯亮兰染色,检查转移效果。

(8) 将其于的NC膜放在一张干净的３MM滤纸上，室温干燥30-60分钟； (5) 用塑料支架夹尽上述各层，放入电转移槽内，NC膜一侧向正极，

(9) NC膜的封闭：将经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液（液面需盖过胶面）室温下轻轻遥荡2-3小时；

(10) 将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定

(11) 将B中封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm2NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，4℃下轻轻震荡2小时。

(12) 洗膜：反应结束，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10分钟；将膜从PBS溶液中转至150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl(pH7.5)溶液中室温下轻轻震荡10分钟。

(13) 将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000；将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0,1ml二抗溶液/cm膜，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡１小时。

(14) 剪开塑料袋，取出NC膜，在150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl(pH7.5)溶液中冲洗1-5次，每次10分钟。

(15) 将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动；

(16) 待条带出现后（约显色1-3分钟），立刻用水洗膜，然后用TE终止。

四、实验结果与注意事项

2

Western bloting要注意的一些问题：

1.一抗、二抗的浓度一般要选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景

2.凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。

3.电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。

4.封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

5.加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景。

6.过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP或者已经反复打开使用多次的AP最好不用。