实验一多酚氧化酶（PPO）的分离与提取

一、实验目的

1、本实验以马铃薯为主要的实验材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

2、通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、实验原理

多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，参与植物抗体的调节，属于末端氧化酶的一种。在植物体受到机械损伤和病毒感染后，PPO催化酚与氧氧化成醌，使组织形成褐变，对PPO弄得的测定便是通过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。

在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶；而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程，该现象称为盐析。蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性，可以依据此分离蛋白，硫酸铵分级便依据此原理，首先在蛋白质溶解度最高时，离心取上清，去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白，之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶，去除尚未析出的杂蛋白，从而达到纯化目的蛋白的目的。多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高，而在75%硫酸铵溶液中沉淀量最高，由此可分离提取多酚氧化酶。但使用硫酸铵分级，分离后的产物中会有铵根离子残留，如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时，残留的铵根离子会造成测定时高于实际值，同时该样品之后会用于离子交换层析纯化，所以需要去除其中的离子，故需要透析去除其中铵根离子。

多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行，在此PH值下，磷酸缓冲液的缓冲能力最强，故选择使用其作为缓冲液，其中加入的EDTA为螯合剂，聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌，本身为固体颗粒，不需要溶解。

三、仪器与试剂：

（1）马铃薯200g

（2）试剂：

溶液A：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯    比咯烷酮）

固体硫酸铵

溶液B：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005M 氯化镁）

实验器械与仪器设备：

烧杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷冻离心机，离心杯，透析袋，植物组织匀浆器，过滤纱布。

四、实验步骤：

1、将马铃薯切削块，按照1g:1ml的比例加入0.03M磷酸缓冲液，放入植物组织匀浆器，将马铃薯充分粉碎使PPO从细胞中释放出来。

2、将处理过的溶液用四层纱布过滤，去除溶液中的大颗粒固性物质，装离心瓶配平后，12000转离心10min。

3、离心后取上清液162ml，查表知欲得到0℃硫酸铵40%饱和度需要加入无水硫酸铵29.92g，称量加入溶液中，用玻璃棒轻轻搅拌，避免因为机械剪切导致蛋白变性，0℃静置一小时。

4、静置一小时后，装离心瓶，调平后离心机12000转离心10min，弃沉淀得上清液192ml，查表知欲得0℃硫酸铵75%饱和度需要再加无水硫酸铵35.90g，称量后加入，用玻璃棒轻轻搅拌，0℃静置2小时沉淀。

5、将透析前样品抽500ul作为粗酶样品。

6、两小时后，装离心瓶，调平后12000转离心10min，弃上清液，沉淀加10ml溶液B复溶，装透析袋绑好透析过夜。

实验二离子交换柱层析纯化多酚氧化酶（PPO）及活性测定

一、实验目的

1、本实验拟通过离子交换层析分离纯化PPO的操作，掌握该层析的基本原理、运用及操作技术。

2、通过纯化PPO检验之前提取PPO的实验是否成功。

3、通过本实验学习并掌握传统的蛋白质活性及浓度测定的方法、原理及相关仪器设备的操作。

二、实验原理

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。 离子交换剂可以分为3部分；高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合, 形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团 上的相反离子,它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用, 称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为；

阳离子交换反应: ( R—X - ) Y + + A + ( R—X - ) A + + Y +
    阴离子交换反应: ( R—X + ) Y - + A - ( R—X + ) A - + Y -
    R代表离子交换剂的高分子聚合物基质, X - 和 X + 分别 代 表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团,Y +  和Y - 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子, A + 和A - 分别代表溶液中的离子基团。

当A离子与离子交换剂的结合力 强于Y离子,或者提高A离子的浓度,或者通过改变其他一些条件,可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层 析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。
    PPO是通过DE52弱碱性阴离子交换剂分离纯化的，过程大体为：阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液 ,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大到顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。

分离过程中的蛋白质浓度是通过考马斯亮蓝技术测定的，考马斯亮蓝法 ( Bradford法)是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，该染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A5 95 n m，与蛋白质浓度成正比。

PPO催化各种酚与氧气氧化为醌，以邻苯二酚为底物，在0.2 M磷酸氢二钠-0.1 M 柠檬酸缓冲液pH=8.5的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410 nm处使反应体系的OD值发生变化，通过OD值上升的度数变化确定PPO的酶活力大小。

三、仪器与试剂：

试剂：0.02M Tris-HCl 缓冲液PH7.4(内含0.001M EDTA)，考马斯亮蓝试剂，

     柠檬酸缓冲液，邻苯二酚，氯化钠；聚乙二醇；DEAE-纤维素DE52；

设备：试管与试管架、烧杯、玻璃棒、滴管等、层析柱，PH试纸，恒流泵，梯度混合仪，核酸蛋白检测仪，GL-20C高速冷冻离心机，酶标板、分光光度计、分析天平、容量瓶、移液管和试管等。

四、实验步骤

（1）将经过透析的PPO蛋白粗酶溶液放入50ml离心管中12000转4℃离心10min，取上清液备用，以此确保无固性物质，防止其破坏胶体。

（2）将层析柱洗净，并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水，将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中，匀速添加防止出现多个柱面，直到柱面到达8cm左右时停止。

（3）装好的层析柱上端连接恒流泵，下端用一烧杯承液，恒流泵首先连接缓冲液，利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来，约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值，直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。

（4）将粗酶液上柱，用微量移液器缓慢加入，加样过程中连续，保证液面在柱面上1cm处，防止液体低于柱材破碎，共上样10ml。

（5）用含氯化钠（0.2-0.6M）的0.02M Tris-HCl缓冲液PH7.4（内含0.001M EDTA）进行梯度洗脱。

（6）每5ml一个试管收集并进行编号，首先收集4管，编号1-4，为杂蛋白，之后收集16管样品，编号5-20，为可能含有PPO的样品。

（7）从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中，加20ul考马斯亮蓝溶液，室温下静置2min，测其OD595值并进行记录，该数据说明其中粗蛋白含量。

（8）从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中，加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min，测其OD410值并进行记录，该数据说明其中多酚氧化酶的含量。

（9）对上一实验中的粗酶提取物样品重复第（7）（8）两步，测其粗蛋白含量及比活力。

（10）0-100 μg/ml标准曲线的绘制：准确吸取0.5ml含20、40、60、80、100μg蛋白标准液，分别放入10ml的试管中，加5.0ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，将溶液混匀，2min后在分光光度计594nm处测定其吸光值，空白以去离子水或蒸馏水代替。吸光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

（11）样品中蛋白浓度的测定：要求待测样品中的蛋白浓度范围为1-1000μg/ml之间，若浓度过高，需要对其进行适当的稀释，再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的0.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白浓度。

五、结果及分析

考马斯亮蓝OD595

柠檬酸缓冲液OD410

粗酶提取物比活力：OD410=0.192

纯化倍数=纯化后比活力/粗酶比活力：0.201/0.192=1.047

结果分析：

图1-1 多酚氧化酶（PPO）离子交换柱纯化结果

多酚氧化酶（PPO）通过离子交换柱纯化的结果如图1-1，横坐标为洗脱体积，对应1-20号试管，共总洗脱体积为100ml。纵坐标为OD值，其中蓝色OD595Z折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化，数值高低表示其中粗蛋白含量多少；红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化，数值高低表示其中酶比活力的高低。所有OD值除0值外，均在0.1-0.8之间，无异常值，无需稀释后在测定。

考马斯亮蓝测定结果中，2号试管即5-10ml的OD595值最高为0.605，为杂蛋白中蛋白含量最高的。而在含有目的蛋白的5-20号试管中，13号试管OD595值最高为0.386，；4-7管OD595最低为0，该OD值说明的是其中的粗蛋白含量，其中共有5个蛋白峰，分别为2号，10号，13号，15号，17号管，其中2号管为杂蛋白峰。杂蛋白洗脱为1-4号试管，通过折线图可观察到，在4号管处，OD595值为0，并在之后5-7管仍然为0，可认为大部分杂蛋白榆次已经几乎洗脱，柠檬酸缓冲液结果也证明了这一观点。

柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中，从10号试管开始出现不为0，此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积，为45-50ml，其浓度一直处于增加状态，直至17号试管处，此处有峰值为0.201,之后酶活性下降明显，与20号试管处其值仅为0.3，可认为PPO以全部洗脱，故PPO洗脱体积共50ml。

纯化倍数为1.047，相较于纯化之前，纯化效果不明显，这与预期的纯化结果相差较多。出现纯化效果不好的原因较多，主要原因可能存在于三个方面：①在多酚氧化酶提取过程中存在问题。可能搅拌时措施不当导致了蛋白质变性，并且有时会碰到烧杯壁，搅拌溶解过程出现的很多气泡都说明很可能是这一步导致了最后纯化倍数偏低。因为全班检测结果均不是很良好，甚至部分组纯化倍数低于1，由此怀疑可能是透析袋存在问题，因孔径太大导致目的蛋白流出，导致纯化倍数降低，这可能是因为原本透析袋口径就过大或在处理过程中导致用力挤压或拉伸导致透析袋孔径变大。②可能是在离子交换柱分离过程中操作不当，灌柱的过程中，柱面高度或许不够高，上柱过程中柱面上方的液体体积过多，导致柱体过密，分离效果不好。③测定OD值时出现问题，在使用时，仪器读数变化极大，每次测定时很不稳定，甚至有20孔全部没有读数的情况出现，可能是使用人数过多，时间过长，导致仪器温度升高，测定值不准导致的。以上三个方面均有可能导致纯化倍数过低，但是无法确认是某一方面单独导致，还是综合因素引起纯化倍数过低，只能在下次实验进行过程中多加注意，避免类似问题再次发生。

实验三  分子筛层析纯化多酚氧化酶（PPO）

一、实验目的

通过分子筛纯化多酚氧化酶（PPO），学习分子筛纯化原理，了解分子筛层析纯化步骤。

二、实验原理

分子筛层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分子筛层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒内部具有立体网状结构形成许多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过分子筛层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

三、仪器与试剂：

试剂：0.02M Tris-HCl 缓冲液 PH7.4（内含0.001M EDTA） 配置是X10倍浓缩液1000ml； 葡萄糖凝胶SePHadex G-200、兰葡萄糖、考马斯亮蓝试剂、柠檬酸缓冲液，邻苯二酚。

设备：试管与试管架、烧杯、玻璃棒、微量移液器、层析柱、PH试纸、恒流泵、核酸蛋白检测仪，GL-20C 高速冷冻离心机、DL-7A大容量低俗冷冻离心机、酶标板。

四、实验步骤

（1）将二中的OD410值最高的17号试管与5ml一中离心后的粗酶提取物混合后离心5分钟，取上清液加入兰葡萄糖，搅拌使其完全溶解后备用。

（2）将层析柱洗净，并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水，将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中，匀速添加防止出现多个柱面，直到柱面到距层析柱柱口1.5-2cm左右时停止。

（3）装好的层析柱上端连接恒流泵，下端用一烧杯承液，恒流泵首先连接缓冲液，利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来，约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值，直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。

（4）用1000ul微量移液器将（1）中加入兰葡萄糖后的样品加入层析柱中，加样过程连续，保证不因为人为因素导致样品分层。

（5）每5ml一个试管收集并进行编号，共收集20管，并记录蓝色于何时开始出现，何时结束

（6）从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中，加20ul考马斯亮蓝溶液，室温下静置2min，测其OD595值并进行记录，该数据说明其中粗蛋白含量。

（7）从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中，加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min，测其OD410值并进行记录，该数据说明其中多酚氧化酶的含量。

五、结果及分析

蓝色于第5管中出现，于第14管中消失，即于20ml开始出现，于70ml时消失。

考马斯亮蓝OD595值：

柠檬酸缓冲液OD410值：

纯化倍数：纯化后比活力/纯化后比活力=0.227/0.192=1.18

结果分析：

图1-2多酚氧化酶（PPO）分子筛层析纯化结果

（1）多酚氧化酶（PPO）通过分子筛层析纯化的结果如图1-2，横坐标为洗脱体积，对应1-20号试管，共总洗脱体积为100ml。纵坐标为OD值，其中蓝色OD595Z折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化，数值高低表示其中粗蛋白含量多少；红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化，数值高低表示其中酶比活力的高低。无高于，0.8的数值，无需稀释后在测定，低于0.1的数值，认为其含量过低，近似于0处理。

（2）考马斯亮蓝测定结果中，6号试管即25-30ml的OD595值最高为0.356，其中粗蛋白含量最高蛋白含量最高的。1-4管与15-20管OD595最低为0，这与蓝色出现与消失的试管号相符，该折线图有其中共有2个蛋白峰，分别为6号，1-号管，蛋白峰和峰值明显低于离子交换层析结果，纯化结果较好。

（3）柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中，从6号试管开始出现不为0，此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积，为45-50ml，其浓度一直处于增加状态，直至10号试管处，此处有峰值为0.227,为酶峰，之后一直下降，与14号管处完全消失。此比活力为0，227高于之前的0.201，纯化效果较上一步好。

（4）纯化倍数为1.18，相较于纯化之前，纯化效果不明显，但较离子交换层析结果有一定这与预期的纯化结果相差较多。该步奏出现纯化效果不好的原因主要问题应存在于两个方面，其一是离子交换层析柱中的多酚氧化酶活性本身就不是很高，分子筛纯化后，提升幅度有限；其二，仪器问题可能仍然会干扰本不实验中的蛋白质以上两个方面综合起来，导致纯化倍数过低，在下次实验进行过程中会多加注意，避免类似问题再次发生。

实验四胰酶分离提取

一、实验目的

1.本实验拟通过从猪胰脏中之美胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。

2.为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

二、实验原理

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2 +的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的相对分子质量约为24000，其等电点约为 PH值为8.9，胰蛋白酶的相对分子质量与其酶原接近( 23300)，其等电点约为PH值为10.8，最适PH值为7.6～8.0，在PH值为3时最稳定，低于此PH值时，胰蛋白酶易变性，在PH值>5 时易自溶。Ca2 +离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子、有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块茎(如土豆、白 薯、芋头等)中也存在有胰蛋白酶抑制剂。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有 的酶原提取出来，然后再根据等电点的沉淀原理，调节PH值以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质， 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级 盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活)，被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白。

三、仪器与试剂：

（1）冻猪胰脏

（2）PH2.5乙酸酸化水、2.5mol/LH2SO4 、5mol/LNaOH、硫酸铵、氯化钙、2mol/LNaOH、0.8mol/L,PH值为9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8 mol/L硼酸溶液,加80ml0.2mol/L四硼酸钠溶液,混合后,用PH计检查校正、0.4mol/L PH值为9 .0硼酸缓冲液( 稀释1 倍即可)、 0.2mol/LPH值为8.0硼酸缓冲液:取70ml0 .2 mol/L硼酸溶液,加30ml0.5mol/L四硼酸钠溶液,混合后,用PH值计校正 )、2 mol/LHCl、0.01mol/LHCl、BAEE-0.15mol/L、PH值为8.0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris缓冲液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化钙)。

（3）恒温水浴锅、离心机、组织粉碎机、PH试纸、烧杯、离心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。

四、实验步骤：

（1）将冷冻的猪胰脏在冰水冲洗下剥离其上的脂肪与结缔组织，减少杂蛋白含量。

（2）将洗净的胰脏放入组织粉碎机后加2倍体积的冷却的PH2.5-3.0的乙酸酸化水后进行粉碎。

（3）检测提取液中PH，若高于3.0则用10%乙酸调节之后再4℃过夜。

（4）将过夜后的样品用四次纱布过滤

（5）将滤液在12000r/min下离心十分钟，取上清液

（6）在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度，静置两小时

（7）将溶液装离心瓶12000r/min离心十分钟，弃上清液

（8）将沉淀用10ml去离子水复溶后装透析袋透析过夜备用

实验五卵清蛋白分离提取

一、实验目的

通过对鸡卵粘蛋白的分离提取，掌握蛋白质分离提取的主要技术和操作，以及相关仪器设备的操作。

二、实验原理

鸡卵黏蛋白存在于鸡蛋清中，对以担保有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵黏蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1，故此可以用鸡卵黏蛋白作为亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。

鸡卵黏蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成分上有差别。有四种不同组分，等电点的范围为PH3.9-4.5,280nm的消光系数为：A=4.13（1%，1cm）。同时鸡卵黏蛋白在中性或酸性溶液中，在25-30℃较高温度下或高浓度的脲中都很稳定，而且本身耐机械剪切，可以根据此设计卵清蛋白提取实验。

三、仪器与试剂：

（1）新鲜鸡蛋两只

（2）10%TCA（用固体NaOH调PH至1.05~1.10,需50ml）、5M HCL、5M NaOH、冷丙酮、BAEE-0.15mol/L、PH值为8.0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris缓冲液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化钙)

（3）恒温水浴锅、离心机、PH试纸、烧杯、离心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。

四、实验步骤：

（1）取蛋清50ml，至于烧杯中，外用温水浴25-30摄氏度，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积三氯乙酸-丙酮（1V：2V），会立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4℃放置过夜。

（2）过夜后样品用四层纱布过滤，去除部分杂质。

（3）将滤液中加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，4℃静置2h。

（4）将静置后的溶液装离心瓶12000R/min离心10分钟，取沉淀。

（5）将沉淀溶于10ml去离子水，复溶后装透析袋过夜透析备用。

实验六亲和层析纯化胰酶

一、实验目的

1. 去除混杂的与胰蛋白酶相近似的蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）和弹性蛋白酶。

2.通过将胰蛋白酶抑制剂——鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。

二、实验原理

亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性(分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离)。如：酶和底物(包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物)的结合。特异性的抗体-抗原(包括病毒、细胞)、激素与其受体、载体蛋白，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。

在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ligand )，在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上( matrix,如SePHarose4B ) 制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。

本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵黏蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵黏蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在PH值为7～8的缓冲溶液中卵黏蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在PH值为2～3时，又能被解离下来。

因此,采用鸡卵黏蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到 10～20 倍以上。

三、仪器与试剂：

试剂：2.5g干重的葡聚糖凝胶SePHadex G-75、0.05M NaI04溶液50ml、纯化的鸡卵黏蛋白87.5mg、5%K2CO3、0.27GKBH4（溶于20ml水）、0.1M Tris-HCl PH7.5（含0.5M KCl，0,05M CaCl2）200ml、粗胰蛋白酶液约50ml、0.1M甲酸钠-0.5M KCl PH2.5 100ml、考马斯亮蓝。

仪器：试管与试管架、烧杯、玻璃棒、微量移液器、层析柱、PH试纸、恒流泵核酸蛋白检测仪，GL-20C 高速冷冻离心机、DL-7A大容量低俗冷冻离心机、酶标板。

四、实验步骤：

（1）将葡聚糖凝胶Sephadex G-75溶胀洗涤数次。

（2）缓慢搅拌，加入0.05M NaIO4溶液50ml，搅拌30min。

（3）蒸馏水洗涤数次，抽干备用。

（4）将二中制备的鸡卵黏蛋白，加入（3）中活化的葡聚糖凝胶。

（5）加入5%K2CO3后，调PH至7.5-9.0，缓慢搅拌2h。

（6）将0,27g KBH4溶于20ml水，缓慢搅拌并加入(5)中再静置过夜备用。

（7）将层析柱洗净，并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水，将静置后的(6)溶液轻轻倒入层析柱中，匀速添加防止出现多个柱面，直到柱面到达8cm左右时停止。

（8）装好的层析柱上端连接恒流泵，下端用一烧杯承液，恒流泵首先连接缓冲液，利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来，约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值，直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。

（9）将一中透析后的溶液装离心瓶离心后，取上清液缓慢加入灌好的层析柱中

（10）上样结束后恒流泵上端接PH7.5缓冲液洗杂蛋白，用试管接杂蛋白样，每管5ml，共取样6管，编号1-6，总体积30ml。

（11）6管杂蛋白洗脱完成后恒流泵上端接PH2.5缓冲液解吸附，洗脱胰蛋白酶，用试管承接滤液，每管5ml，共采样15管。

五、结果及分析

（1）考马斯亮蓝OD595值：

结果分析：

图2-1 胰蛋白酶亲和层析考马斯亮蓝粗蛋白含量折线图

猪胰蛋白亲和层析结果如图2-1所示，图折线为加入考马斯亮蓝后的OD595值，为其中蛋白含量，所有值均小于0.8，不需要稀释后再测定。从图中可知有共有3个蛋白峰，分布为1号试管，3号试管和11号试管，其中1号试管与3号试管是用PH7.5缓冲液进行洗涤的，此时胰蛋白酶与固定相以共价键结合，不会洗脱，股此时试管中应为杂蛋白，曲线整体为下降趋势，于6号试管处有杂蛋白最低值，此时OD595值为0.044，可近似认为杂蛋白已经被洗脱。7-21号试管是用PH2.5解吸附后收集的，其内主要蛋白质来源是之前被固定相吸附的胰蛋白酶，由于之前杂蛋白洗脱程度良好，可认为其中几乎没有杂蛋白，故11号试管为胰蛋白酶蛋白峰，峰值为0.367，之后一直下降，于20号试管处OD值为0，认为所有胰蛋白酶全部洗脱，总洗脱体积为65ml。

因为胰蛋白酶来源是猪胰脏，故其为未激活胰蛋白酶，同时实验过程中未进行激活步骤，故无法确定其中的酶活性，也无法分析纯化倍数。

实验七 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质纯度

一、实验目的

1.对多酚氧化酶的纯度进行鉴定以及进行分子量的测定。

2.通过本实验，学习掌握SDS-PAGE测定蛋白质纯度以及分子量的鉴定方法。

二、实验原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺加入去污剂SDS，因为大多数的蛋白质能与SDS按一定比例结合，使各种蛋白质的SDS-蛋白质复合物带上相同密度的负电荷，它的电量大大超过了蛋白质分子原有的，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

三、仪器与试剂：

1、实验一中多酚氧化酶粗酶、透析后、离子交换柱纯化后、分子筛纯化后样本，实验二中胰酶粗酶、透析后、亲和层析样本，实验三中DNA、质粒、λDNA样本。

2、丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis），10％的SDS溶液，10％的过硫酸铵溶液，四甲基乙二胺（TEMED），1.5M Tris,PH8.8，1.0M Tris,PH6.8，10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3，0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰，0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液，50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液，标准分子量蛋白。

3、电泳仪，垂直电泳槽，微量移液器

四、实验步骤

1、用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。

2、将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。

3、分别向样品离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min，取出待用。

4、用微量注射器分别吸20ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。

5、点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2－3mA/em），保持电流稳定不变，进行电泳。

6、当溴酚蓝迁移到离分离胶底1－2cm时，停止电泳。

7、电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。

8、倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。

实验八 western-blotting

一、实验目的

1.鉴定蛋白质表达的情况。

2.通过本实验系统掌握western-blotting鉴定蛋白表达情况的原理、操作及结果分析。

二、实验原理

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

三、仪器与试剂：

试剂：匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml；转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml；0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml；膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中；显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。

仪器：烧杯，硝酸纤维薄膜，

四、实验步骤

（一）SDS-PAGE实验见之前的。

（二）电转

1. 剪6块3mm滤纸和一块NC膜。

2. 将剪好的3mm滤纸和一块NC膜在转移液中浸泡3-5min。

3.按下列过程安装转移装置，将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。

4.将3块3mm滤纸对齐放在海绵上，然后依次将NC膜、凝胶、及另3块滤纸和海绵放上。

5.用塑料支架夹尽上述各层，放入电转槽中，NC膜一侧向正极。

6.接通电源电压40V，电流0.17-0.2A，转移1.5-6小时。

7.转移结束后，取出塑料支架，依次取掉各层，用铅笔在膜的上沿做好标记，切下其中一个孔对应的膜的一半，用氨基黑或考马斯亮蓝染色，检查转移效果。

8.将其余的NC膜放在一张干净的3mm滤纸上，室温干燥30-60min。

9.NC膜的封闭：

将经电转并干燥的NC膜放于一瓶皿上，加入封闭液室温下轻轻摇荡2-3小时。

10.将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定。

11.将B中封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm²NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，4℃下轻轻震荡2小时。

12.洗膜：反应结束，将塑料袋剪开，弃去废液，用PBS洗三次，每次10min，将膜从PBS溶液中转至150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH=7.5)溶液中室温下轻轻震荡10分钟。

13.将二抗用二抗封闭液稀释，稀释度为1:200-1:2000。

将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0.1ml二抗溶液/cm²NC膜，封闭塑料袋，

14.剪开塑料袋，取出NC膜，在150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH=7.5)溶液中冲洗1-5次，每次10分钟。

15.将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动。

16.带条带出现后（约显色1-3分钟），立刻用水洗膜，然后用TE终止。

实验九酶联免疫分析技术

一、实验目的

通过ELISA实验操作鉴定胰酶并确定其浓度，掌握ELISA实验操作步骤和基本原理。

二、实验原理

1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。最初发展的免疫酶测定方法。是使酶与抗体或抗原结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，俗称ELISA(enzyme linked immunosorbant assay)。

 众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体成抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜相电子显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。

酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。

根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。

三、仪器与试剂：

1、实验二亲和层析纯化后胰酶样品。

2、胰酶抗体，AP标记二抗，包被液PH9.6碳酸盐包被缓冲液: 3.03g Na2CO3, 6.0g NaHCO3, 溶解于900ml双蒸水中，检测并调整pH至9.6，定容至1L；PBS：1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl ，溶于500mL 蒸馏水中，调整pH至7.4；封闭液：溶于PBS的1% BSA，血清，脱脂牛奶，酪蛋白或明胶等。洗涤液：PBS或是TBST（Tris-HCl,pH7.4 + 0.05% 吐温20）；抗体或抗原稀释液：1×封闭液；终止液：根据实验检测系统可采用不同的终止液。

3、酶标板、微量加样器、带盖搪瓷盘、37℃培养箱、酶标仪、小试管等。

四、实验步骤

1、采用十字交叉连续稀释分析法确定抗原浓度，抗原浓度一般为0.2 to 10μg/ml，最好不要超过20μg/ml。

2、将50μl用碳酸盐包被缓冲液稀释的抗原加入96孔酶标板中，用塑料膜板将孔板覆盖后置于室温2小时或4度过夜。

3、弃去包被液用洗涤液洗涤3次，轻拍孔板使洗涤液甩干。

4、每孔中加入200μl封闭液（1%BSA或5%脱脂牛奶等），盖上膜板，室温封闭至少2小时或4度过夜。

5、封闭后用PBS洗涤两次。抗体孵育

6、每孔加入稀释好的抗体100μl，室温孵育2小时或4度过夜。

7、孵育后用洗涤液洗涤四次。

8、每孔加入100μl的底物溶液，待显色充分后加入100μl的终止液并在酶标仪上测定相应波长吸光度值。

实验十染色体DNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习和掌握提取染色体DNA的原理及方法，并为下一步实验做准备。

二、实验原理

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。本实验中通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提。使DNA进入水相与担保成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。

三、仪器与试剂：

1.材料：大肠杆菌

2.试剂：细胞裂解液（100mM Tris-HCL、5mM EDTA、500mM NaCl、1.25% SDS、PH 7.5）；饱和酚；氯仿；70%酒精

四、实验步骤

1、取培养菌液加入10ml裂解液，加入1ml酚，等体积氯仿，在65℃下水浴半小时。

2、水浴后12000r/min离心15min，取上清液。

3、在上清中加入等体积氯仿，轻轻摇动，在此12000r/min离心15min，取上清液。

4、在上清液中加入2体积无水乙醇（-20℃）与0.1体积3M乙酸钠（PH5.2），室温下静置10min。

5、12000r/min离心15min，取沉淀。

6、用70%乙醇洗三次沉淀，之后12000r/min离心10min。

7、将沉淀真空干燥后，复溶于2ml去离子水水中。

8、加RNaes摇匀后，在65℃中水浴30min。

9、加等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000r/min离心15min。

10、取上清液，加入无水乙醇，3M乙酸钠（PH5.2），12000r/min离心15min。

11、去沉淀，重复（6）步后干燥复溶-20℃保存。

五、结果及分析

分析：DNA提取物电泳结果如图3-1所示，可以清晰看到呈梯状的明显亮带，上样口物干净，整体条带清晰，说明蛋白质去除干净，无杂质残留，DNA提取效果良好，可用作下一步实验原料使用。

实验十一质粒DNA的提取与纯化

一、实验目的

通过本实验，掌握大肠杆菌质粒提取原理和方法，为之后实验准备材料

二、实验原理

细菌质粒多为一些双联、环状的DNA分子，其大小范围从1KB-200以上KB不等，他们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋予菌体一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。由于有些质粒与DNA分子量较小特别是与自身遗传有关的DNA分子绩效，可携带外援基因量较大，且转移性强、拷贝数高（松弛型质粒）、还带有选择性标记，因此质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。质粒DNA的提取可以说是以不同的方法，但基本步骤多为散步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒DNA的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒DNA提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要是煮沸法，SDS法，碱解法，Triton-溶菌酶法等。质粒DNA的纯化方法主要是梯度离心法，柱层析法等，但由于目前所用质粒复制量极大，小量常规制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段分离、常规亚克隆及探针等方面的工作需要，因此在实际工作中，除非有极特殊的要求，很少有人进行质粒DNA的梯度离心及柱层析纯化。

三、仪器与试剂：

（1）培养用大肠杆菌菌体

（2）超净工作台、培养箱、摇床、高速冷冻离心机、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、取仪器一套、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、电泳仪、水平电泳槽。

（3）Solution I （50nM葡萄糖，25mM Tris-HCl PH=8.0，10mM EDTA PH=8.0,高压灭菌，4℃保存）、Solution II（0.2M NaOH，1%SDS，现配现用）、Solution III（5N KAC PH 4.8高压灭菌，4℃保存 ）、3M NaAC PH 5.2 高压灭菌，4℃保存、 氨苄青霉素 25mg/ml、溶菌酶 8mg/ml、氯仿/酚、异丙醇、

四、实验步骤：

1、20ml培养菌体37℃ 20rpm 过夜。

2、取出菌液后4℃，5000r/min离心10min。

3、取沉淀用预冷的TES缓冲液洗涤，4℃，5000r/min离心10min。

4、取沉淀加入1ml Solution I，冰浴10min。

5、重新悬浮，加入150ul溶菌酶木业，室温5min。

6、加入1.2ml Solution II，冰浴5min。

7、加入0、9ml预冷乙酸钾，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。

8、取上清液，加入1.5ml异丙醇，-20摄氏度，冷藏15min。

9、4℃，12000r/min，离心10min。

10、取沉淀悬于200ulTE缓冲液中，加入40ul，3M NaAC。

11、酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后4℃，12000r/min，离心10min。

去沉淀后冷冻干燥，再悬浮于50ulTE中备用。

五、结果及分析

分析：质粒提取结果如图3-2所示，其中同一泳道内的三个条带分层明显，符合质粒的电泳图，造成这一现象，是因为质粒的三种不懂构象导致的电场中的迁移速度有差异，最终迁移距离发生变化，图3-2中条带清晰，无杂带，说明质粒DNA提取效果良好，该实验结果可用作下一步实验使用。

实验十二酶切技术

一、实验目的

通过EcoR I，Hind III两种限制性内切酶对λDNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，掌握内切酶实验原理及步骤，为之后实验做准备。

二、实验原理

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

　　5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
　　    3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
　　DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
　　构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
　　在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。

三、仪器与试剂：

（1）λDNA

（2）水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。

（3）Ecor I及缓冲液、HindIII及缓冲液、λDNA 0.532ug/ul、TAE缓冲液

四、实验步骤

1.取一干净的灭菌的离心管加入30ul溶液，体系见下表。

2.37℃保温1-2小时。

3.保温结束后，加入0.5M（PH7.2）EDTA（使终浓度达到10mM）。

4.加入6ul电泳缓冲液，电泳分析。

五、结果及分析

分析：可看到明显的条带，条带数目较多，说明酶切效果良好，因为其中并未加入marker，故无法比对酶切后DNA片段长度，只能通过之后的连接与转换确认本次酶切效果，因为图中为各组分别完成的独立实验，彼此间条带与图中位置一致，可一定程度说明酶切效果良好，可用作连接使用。

实验十三 DNA片段的连接技术

一、实验目的

本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。

二、实验原理

DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。

三、仪器与试剂：

仪器：离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器
试剂：T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAc

四、实验步骤

1.取干净、灭菌新离心管管，按下表加入各试液。

2.19--20℃ 保温2小时

3.提取已连接好的DNA片段。电泳分析。

实验十四  受体菌感受态细胞制备及重组片段的转化、克隆和筛选

一、实验目的

本实验通过相关技术的操作，掌握感受态细胞的制备及转换技术的原理和操作过程。

二、实验原理

1、当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。

2、转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。

三、仪器与试剂：

（1）大肠杆菌
（2）离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
（3）LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ; TFB：10mM MES（pH 6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl

四、实验步骤

1、将大肠杆菌在LB培养基平板上划线培养12-16小时。

2、挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。

3、取1ml培养物7000rpm，离心3min，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。

4、用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。

5、用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。

6、加入200μl预冷的氯化钙（或TFB），放置于冰浴，即得感受态细胞。

7、向制备好的感受态细胞中加入溶于TE的待转化外源DNA，冰浴30min。

8、42℃热冲击2 min。

9、冰上2min。

10、加入0.4 ml LB液体培养基，37℃保温摇床45 min。

11、取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上，37℃培养。

五、结果及分析

分析：

培养皿上有白色菌落和兰色菌落，但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色，所以白色菌落说明转化成功；兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接，若是在原酶切位点的连接进行的转化，菌落为白色；若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化，菌落为兰色（说明在酶切上成功，连接上也成功，转化上也成功）。转化后结果如图3-1、图3-2所示，图3-1中共有29个白色菌落，图3-2中共有32个白色菌落，总计有61个，共使用了DNA2ug.

转化效率=每mg蛋白质生成菌落数=61个/0.002mg=35000

通过肉眼观测，可看到图3-2中菌落生长良好，菌落并不很密集，同时周边没有小的卫星菌落，说明其中氨苄青霉素浓度适中，且视野中蓝白菌落均有；但图3-1中，菌落周围有许多小的卫星菌落，这说明氨苄青霉素浓度过低，会影响之后挑菌落工作。