实验一、质粒DNA的提取及检测

【实验目的】

1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤

2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

3、学会PCR操作的基本技术

第一部分 质粒DNA的提取

一、实验原理：

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂

1、仪器 恒温摇床、台式离心机

2、试剂 溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿

三、实验步骤

1、 将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19

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上海澳斯泰医学检验所

基因检测报告

患者姓名： 样品编号： 送检单位： 委 托 人： 联系电话： 委托日期：接收日期： 20xx年11月24日 报告日期： 20xx年11月26日

上海源奇 / 电话：021-37196264 本检测结果仅供科研参考

样本提供者信息 样本编号：

病 理 号：

病 区：

床 号：19

科 室：胸外科

姓 名：

性 别：女

出生日期：19xx年7月22日

临床诊断：

样本种类：新鲜组织

样品数量：1

检测项目内容

检测项目1：肿瘤个体化治疗疗效相关融合基因检测

1. 检测内容：EML4-ALK融合基因

2. 检测方法：实时定量逆转录聚合酶链反应 (QRT-PCR)

3. 主要材料：ABI荧光定量试剂盒 源奇生物肿瘤相关融合基因检测试剂盒

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                       上海市同济医院

                    用药相关基因测定报告及分析

姓名：王立平       性别：男           年龄：36        科室：肿瘤科

病区：同四          床位：18          住院号：515852

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荧光素酶报告基因 原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

步骤：

1、 (1) 铺细胞于 24 孔板中，{选用48孔板（如果比较难做的系统可以选用24孔板甚至12孔板，细胞量越多表达的酶相应越多），铺板密度约为30%（如果比较着急做实验，密度可以提高）。}每孔细胞数为 20 万细胞左右，待细胞融汇度达到70% （适合磷酸钙转染）、 85% （适合脂质体转染）时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染（因为转染后要让质粒表达一定的时间，一般是18-24小时，故而这个细胞密度到加药时密度会差不多到100%）。转染体系的配置：目标蛋白的质粒（pBind-），luc质粒，fermentas转染试剂，（质粒：转染试剂=1：1-3（μg：μL）这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。

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无创基因检测报告领取单

姓名：_____________________________ 条码：__________________________________

您好，检测结果一般在12个工作日出具（检测结果未见异常会短信通知，结果异常会电话通知），3周后持此单到医院抽血室领取报告和#5@p。报告需邮件孕妇，邮费到付，收件人需是本人名字。

报告领取时间：

（其它时间无人接待，请勿前来，谢谢配合！）

无创基因检测报告领取单

姓名：_____________________________ 条码：__________________________________

您好，检测结果一般在12个工作日出具（检测结果未见异常会短信通知，结果异常会电话通知），3周后持此单到医院抽血室领取报告和#5@p。报告需邮件孕妇，邮费到付，收件人需是本人名字。

报告领取时间：

（其它时间无人接待，请勿前来，谢谢配合！）

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来自200名妈妈的DNA检测儿童安全用药试用体验报告

20##-06-03　　　来源: 综合消息

今年4月中下旬,美国食品和药品监督局（FDA）在对强生华盛顿和宾夕法尼亚州的工厂进行例行检查中,发现强生的部分药品存在质量问题。于是,美国FDA于4月30日命令强生召回部分产品。强生召回事件将儿童安全用药问题一下推到了风口浪尖，据世界卫生组织发表声明，每年全球约有上千万5岁以下儿童死亡，其中三分之二儿童的死于用药不当，如果正确用药每年可以避免数百万儿童的死亡。在中国，据20##年参加国家药品不良反应监测的儿童医院报告数据显示，儿童服药不良反应发生率平均达到12.9%，其中新生儿是24.4%，越是年幼的儿童， 用药不良反应越严重。

事实上，儿童用药安全问题其实很好解决，比如在国外最流行的方法就是DNA检测：通过DNA检测，可以了解到孩子对哪些药物会产生不良反应，从而避免在生病后使用这些药品，也就可以从根本上避免因用药错误导致孩子发生意外。

从新生儿到18岁的儿童都可以接受安全用药DNA检测，越早通过基因了解孩子的吃药体质，让基因检测指导孩子的选药，越能大大减少吃药损害，得到更有效的治疗。儿童用药安全基因检测能够帮助爸爸妈妈和医生选择更适合孩子吃的药，调整用药剂量，正确搭配不同药物，将吃药的伤害降到最低。通过基因了解孩子的吃药体质，让基因检测指导孩子的选药，越能大大减少吃药损害，得到更有效的治疗。

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版本A

***市人民医院

耳聋基因检验报告单

年龄：26 标本类型：全血 位点名称 235 del C 299 del AT 1494 C >T 1555 A >G 2168 A >G IVS7-2 A >G

科别：妇科 申请医生：王丽梅

标本号：201405120034

姓名： 李兰 性别： 女 序号 1 2 3 4 5 6

基因名称 GJB2 GJB2

mtDNA12SrRNA mtDNA12SrRNA SLC26A4 SLC26A4

接收时间：20140513 检测结果

杂合突变 野生型 野生型 野生型 纯合突变 野生型

检测日期：检测者： 核对者：

*结果仅对送检样本负责，有疑问请于三日内咨询*

1.本实验仅用于检测导致遗传性耳聋最常见的3个耳聋基因6个突变位点（约占全部遗传性耳聋相关突变位点的80%）。不能对所有耳聋进行病因诊断。

2.本检测结果需结合临床表现等专业分析。

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乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。

数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。易干扰，可多次查。

即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。

乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用

1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。

2、乙肝病毒是否复制。

3、乙肝是否传染，传染性有多强。

4、是否有必要服药。

5、肝功能异常改变是否由病毒引起。

6、判断病人是适合用哪类抗病毒药物。

7、判断药物治疗的疗效。

如何看乙肝病毒DNA检测报告

1、乙肝病毒DNA检测报告：主要包括定性和定量。

2、定性，即确定是阴性还是阳性。乙肝病毒DNA的正常值为阴性，即乙肝病毒DNA<1x10的3次方拷贝/ml

3、定性测得的阳性通常说明病毒容易传染给他人，阴性说明不容易传给他人。对于乙肝大三阳来说，由于乙肝病毒e抗原(HBeAg)是阳性，所以乙肝病毒-DNA也是阳性的，表示乙肝病毒-DNA>1 x 10的3次方拷贝/ml ，这时体内的乙肝病毒复制活跃。

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