大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选

1.前言

抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有 DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

…… …… 余下全文

国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数

实验目的

实验原理：国标法操作的原理

实验器材：

培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台

实验药品：

磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl

实验步骤：

一：

10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。

用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min

二：

1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水加入该锥形瓶中，制成培养基。

3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。

4：灭完菌后放入超净台中备用。

三：

1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS

…… …… 余下全文

一、实验方案设计

二、实验报告

 

三. 实验总结

…… …… 余下全文

分离

划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。

涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。

（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）

1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml

（配固体培养基再加琼脂20克）

2、流程

计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板

培养基配制(特)

       培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、              按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：

例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份]

2、              用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。待灭菌。

①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。

…… …… 余下全文

广州大学化学化工学院

本科学生综合性、设计性实验报告

实验课程 食品微生物实验

实验项目 大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定

专业 食品科学与工程

班级 食品131

学号

姓名 

指导教师 

开课学期 20XX学年 第一 学期

时 间年月日

一、实验方案设计

二、实验报告

三. 实验总结

…… …… 余下全文

    南昌大学实验报告

学生姓名：      彭学政         学    号： 6002212005     专业班级：给排水121班           

实验类型：√ 验证 □ 综合 □ 设计 □ 创新   实验日期：2014.12.2 实验成绩：      

水处理微生物学实验实验设计：

水体中总大肠菌群的检验

一、实验目的

1、掌握水中细菌总数测定方法；

2、掌握多管发酵法（MPN)测定水中大肠菌群的方法；

3、了解大肠杆菌数量与水质状态的关系；

4、了解大肠杆菌的数量在饮用水中的重要作用；

5、掌握污水细菌总数测定方法。

二、实验原理

    大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

…… …… 余下全文

实验三     Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白

一、实验目的

    利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。

二、实验原理

黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C₂和C₃之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O₂  a Flavonol + succinate + CO₂ + H₂O。

本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn ?酶切位点，去掉终止密码并引入BamH ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 × His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。

…… …… 余下全文

1 引言

在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主^[1]。感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法

2.1 实验原理

质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

…… …… 余下全文