分离

划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。

涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。

（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）

1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml

（配固体培养基再加琼脂20克）

2、流程

计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板

培养基配制(特)

       培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、              按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：

例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份]

2、              用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。待灭菌。

①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。

②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_ 6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。

③包扎：用_牛皮纸__或报纸

④灭菌：高压蒸气灭菌法   1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆  _.

                                                    2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。再以__两两对称  方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺

栓松紧一致，勿使漏气。   3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。4）保温保压：当锅内压力升到 1_kg/cm²时，控制热源，维持压力至15  _min。                                 5）出锅：  切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。        否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。

灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。

⑤倒平板、制斜面

操作平台：超净台

灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外线 _和_过滤风，灭菌30min.

倒平板：待培养基冷却至__60_ ℃时，将每只培养皿倒入_10~12_ml未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。_倒置_备用。

制斜面：将未凝固的固体培养基的试管斜 放，冷却待凝使即成为斜面。

思考题：

一、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？

1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。

2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。

3、整个操作在酒精灯火焰旁进行

4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。

二、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？

可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

三、为何要将平板倒置？

平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。

四、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

五、如何检查培养基是否受杂菌的污染？

将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。

（重点）液体培养基接种培养

主要器具：接种环、摇床等

操作方法：先将接种环进行   灼烧_灭菌, _冷却_后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于_37___℃摇床振荡培养１２小时。

思考：如何冷却接种环？

可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的目的。

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？

       操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。

2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

以免接种环温度太高，杀死菌种。

4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？

如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。

（五）斜面接种及菌种保存

主要器具：接种环、恒温箱、冰箱

操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_单__菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在__斜面___上， __37___℃恒温培养箱中培养_24___小时后，__4__℃ 冰箱保存。

无菌操作：同前

思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？

试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。

 

6、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?

(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度

 

 

7、在培养后如何判断是否有杂菌污染?

（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。

（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。

（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。

8、实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?

          所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。

 

实验一  大肠杆菌的培养和分离

实验步骤：

一 、配制LB培养基

计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌

二、倒平板、制斜面

三、 大肠杆菌的培养    使所需细菌大量繁殖

四 、大肠杆菌的分离    获得单菌落，纯化菌株

平板划线分离法（或稀释涂布平板法）

五、 斜面接种培养  目的菌株的纯培养和菌种保存

大肠杆菌的培养和分离实验操作

（一）培养基的配置与灭菌

取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。

封口膜：既通气又不使菌进入

LB液体培养基——细菌的扩大培养

LB固体培养基——细菌的划线分离

（二）倒平板

灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。

注意事项：

1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来倒平板

2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

 3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.

4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌

5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.

（三）大肠杆菌的扩大培养

将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。

注意事项:

1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;

2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;

3.取菌后封口膜和棉塞复原.

?             菌种扩增       摇床震荡培养12h（于LB液体培养基中）

 

第二篇：制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法总结：

Inoue法制备感受态大肠杆菌总结

1． 培养基的准备

SOB培养基： 100ml

胰化蛋白胨       2  g

酵母提取物      0.5  g

NaCl           0.05  g

250mM KCl      1    ml

高压灭菌      

使用前加 2mol/L  MgCl₂         0.5  ml

SOB琼脂板（含20mmol/L MgSO₄ 和20mmol/L 氨苄） 100ml

胰化蛋白胨      2    g

酵母提取物      0.5  g

NaCl            0.05 g

琼脂            1.5  g

250mM KCl      1    ml

高压灭菌       50℃温浴

再加 2mol/L  MgSO₄         1   ml

     2mol/L  MgCl₂        0.5  ml

     20mg/ml 氨苄         100  ul

混均倒平板（90mm²）

SOC培养液    50ml

胰化蛋白胨       1  g

酵母提取物      0.25  g

NaCl           0.025  g

250mM KCl      0.5    ml

                2mol/L  MgCl₂         0.25  ml

1mol/L  葡萄糖(0.22um过滤除菌)         1   ml

2．  INOUE转化缓冲液的准备：(250ml)

 

MnCL₂.4H₂O            2.72g       

CaCL₂.2H₂O            0.55g              定容到250ml

KCL                   4.6625g

PIPES(0.5mol/L,PH6.7)    5 ml

1. 45μm孔径滤膜过滤，分50ml每份—20℃保存

3． 挑取一个经37℃培养19h平皿上的单菌落（2~3mm直径），接种至250ml 锥形瓶中的25ml SOB培养液中，37℃摇床（250~300r/min）培养6~8小时。（此时培养物OD₆₀₀约0。680）

4． 从上述的25ml 的初始培养物接4ml大肠杆菌于盛有100ml SOB 的500 ml锥形瓶中，于18~22℃中速摇床过夜。

次日取出达到OD值0.55时的培养液置于冰浴中10min。

5． 平均分装到两个50ml的贝克曼离心管于4℃以2500g 在贝克曼离心机上离心10min收集菌体。

6．  倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，用真空吸引器将贴附在管壁的培养基吸干。

7．  加32ml冰预冷的Inoue转化缓冲液轻轻旋转重悬细菌(没有用枪吹吸和振荡重悬)

8．  于4℃ 2500g离心10min 收集菌体。

10．倒去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min 以吸干剩余液体，用一真空吸引器将附在管壁上的培养基吸干。

冻存感受态细胞

11．用8ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀(此时两管混合于一管)。

12．向剩余的细胞中加0.6mlDMSO，混匀冰浴10min.

13．迅速将悬液分装到冷却的无菌1.5ml离心管中（每管200ul），没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。

转化

15．要转化的PET加入装有感受态细胞（加DMSO保存于-70℃的感受态细胞）的管中，轻轻旋转几次混匀内容物。设一对照管：只有感受态细胞。冰浴30min [保存于-70℃的感受态细胞从冰箱拿出后用手心溶解后立即在冰浴上冰浴10min,然后再加INSERT DNA.]

16．将管放入预加温到42℃的水浴中，恰恰放置90s，不要摇动。

17．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。

18．每管加800μl在37℃培养箱中温浴到37℃的SOC培养基，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min（中速温和摇培），使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗标记基因。

19．将200μl体积的已转化的感受态细胞转移到含抗生素和20mmol/L,MgSO₄SOB培养基上。于37℃培养箱正放到液体被吸收。

20．倒置平皿12~16h后可出现菌落。

转化PET标准质粒的结果如下图:

         

图A    转化10μl浓度为50ng/μl的PET标准质粒

              

图B    转化2μl浓度为50ng/μl的PET标准质粒

              

图C  空白对照

分析：（仅与本人每次成功的经验为准，供参考）

1、本实验所用的菌株是XL₁—BLEU ，注意不同种的大肠杆菌的各种参数不同。

2、培养基需新鲜配置，液体培养基的瓶子要专用，每次使用后洗净凉干后，锡铂纸封口，使用前只用清水洗后蒸馏水荡几遍，最后用超纯水润洗两遍。注意专用器皿都不用任何清洁剂，第一次使用时可以用稀的洗液浸泡。

3、培养初始培养物的培养基可以用SOB或LB，其它步骤中所用各培养基均用SOB（MgCl₂需在使前加）。

4、大体积培养菌时如温度固定在18~22℃，有如下细菌OD₆₀₀的增长经验数值,多次记录时发现增长的情况相近，以一次记录为例希望能为以后制作时带来一点方便：

时间                    OD₆₀₀

                       6：40                     0.100

                       7：40                     0.134

8：40                     0.165

9：40                     0.195

                       10：20                    0.218

                       11：24                    0.258

                       12：19                    0.303

                       13：00                    0.327

                       13：50                    0.386

                       14：50                    0.433

                       15：45                    0.483

                       16：18                    0.520

                       16：40                    0.545

16：50                    0.553

5、实验中有两次重悬沉淀步骤中要注意，勿用枪头吹吸的方法，只需在加入缓冲液以后轻轻悬转离心管就行了（轻重的标准是重悬时不会使里面的液滴飞溅）。

6、感受态细胞有液氮速冻后于-70℃可以长期保存（半年内感受性不会下降，以后将再继续延长观察期）。

7、转化实验中最关键的是热激一步，温度，时间绝对准确性。还需要注意的是在热激过程中离心管不能摇动，包括在取出离心管时都不能摇动，取出后立即放入冰浴中静置2min。