酶活力测定方法的研究

一．研究背景及目的

           酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。本实验选取萌发的禾谷类种子为材料，通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。

二．           实验原理

    萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α淀粉酶和β淀粉酶，β淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化^[1]。本实验的设计利用β淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β淀粉酶钝化而测定α淀粉酶的酶活性^[1]。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性，拟将总活性与α淀粉酶的活性的差值看作β淀粉酶的活性，再做进一步分析。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。

三．           材料、试剂与仪器

材料：

萌发的小麦种子

试剂：

① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）；

② pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）

B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即可；

③ 3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）；

④ 麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；

⑤ 0.4M NaOH

仪器：

722光栅分光光度计(编号990695) 

DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) 

离心机(TDL-40B)  配平天平  药物天平  电热锅

100ml容量瓶 50ml容量瓶  移液管  试管  研钵  烧杯  洗瓶

四．           实验方法

     本实验按照下列表格的中的操作步骤进行：

    

五．           数据整理    

     上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），根据标准曲线的方程，计算上表中第4行数据（各样品的OD值）所对应的麦芽糖浓度，填入上第5行中，计算两组平行实验所测麦芽糖浓度的平均值，填入最后一行，如上表。

六．           结果计算与讨论分析

根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：

α淀粉酶活性=（A－A’）×样品总体积÷（样品重×5）

(α+β)淀粉酶活性=（B－B’） 样品总体积÷（样品重×5）

其中A为α淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度，A’为α淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度，B为(α+β)淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度，B’为(α+β)淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度（以两组平行实验数据的平均值计算）

计算结果如下：

     α淀粉酶活性=10.9（毫克麦芽糖?克^-1鲜重?分钟^-1）

     (α+β)淀粉酶活性=236（毫克麦芽糖?克^-1鲜重?分钟^-1）

     (α+β)淀粉酶活性与α淀粉酶活性的差值为225（毫克麦芽糖?克^-1鲜重?分钟^-1），暂且看作β淀粉酶活性来分析问题。

由以上的结果可以看出：测得的β淀粉酶活性远远高于α淀粉酶活性。根据实验的可操作性，我们有理由相信α淀粉酶活性的测量值是可信的，但是对于β淀粉酶活性，我们不得不提出这样一些疑问：同是小麦发芽种子中的淀粉酶，活性为何存在如此大的差异？β淀粉酶活性的测量值可信吗？α淀粉酶和β淀粉酶共同的催化能力会等同于它们各自崔化能力的算数和吗？带着这些问题，我查阅了相关文献，结果没有找到关于α淀粉酶与β淀粉酶相互关系的文献，但是发现：在前人的研究中，已经广泛运用了通过α淀粉酶和β淀粉酶总活性与α淀粉酶活性的测定间接得到β淀粉酶活性的方法^[3]，而且在一些类似的实验中测定的结果也是β淀粉酶活性远远高于α淀粉酶活性^[2] 。但是这一测定β淀粉酶活性方法的科学性仍然值得怀疑，因为β淀粉酶与α淀粉酶的催化特性是有差异的。β淀粉酶主要作用于直链淀粉，作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了；而α淀粉酶则无差别地作用于直链淀粉与支链淀粉^[4]。所以我提出设想：β淀粉酶单独作用时催化能力要大打折扣。不过值得注意的是：本次实验中所用淀粉的结构尚不明确。

七．           结论与展望

根据上面结果与分析，作出如下总结：对于酶活性的测定，通过测定一定时间内一定量的酶催化所得产物的量来表征酶的活性不管在逻辑上还是可操作性上都是可行的。但是通过测定两种酶共同作用时的总活性及其中一种酶的活性从而间接得到另一种酶的活性的方法是值得质疑的，当然我们可以参考前人的实验经验，但是质疑是不可少的。本实验中运用的通过α淀粉酶和β淀粉酶总活性与α淀粉酶活性的测定间接得到β淀粉酶活性的方法当然也是值得质疑的，至少仅仅通过本实验是不能消除这样的质疑的；但是查阅文献后发现该方法被广泛运用，所以其合理性应该是得到前人证明的，但尚未查到相关的文献，有待进一步的考证。

八．           思考题

    1．a-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的40℃温浴的酶促反应中就能保证b-淀粉酶不会再参与催化反应。

        由于b-淀粉酶不耐热，在70℃下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，a-淀粉酶活性也会受到影响；时间不足，b-淀粉酶钝化不完全。保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变b-淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复性，这样就保证了在随后的40℃温浴的酶促反应中b-淀粉酶不会再参与催化反应。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。

2．酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般0℃以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构。

     在最适反应温度下，酶的催化活性最大，此时的酶与底物的结合性最强；而在最适保存温度下，酶的稳定性最好，此时的酶一般处于失活状态。这是完全不同的两个状态，所以温度不同是可以理解的。

3．为什么3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？

    根据化学反应动力学的原理，高浓度下的反应更完全，为了测定结果的准确，所以当然希望还原糖尽可能完全地参加反应；但是比色法允许测定的浓度是较低的。3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应在高温下进行，所以先沸水浴使还原糖最大程度地反应再稀释测定能够准确测得所含还原糖的浓度。

4. 在体外进行别构酶活性调控的实验中，有时可以用低浓度的竞争性抑制剂作为酶的别构激活剂使用，其理论基础是什麽？

    竞争性抑制剂与被抑制的酶的底物通常有结构上的相似性，能与别构酶的别够中心结合，从而改变酶分子的构象，增强酶的活性，成为酶的别构激活剂。

5.  在酶的分离纯化过程中通常会丢失一些活力，但有时亦可能在某一纯化步骤中酶活力的得率超过100%，产生这种活力增高的可能原因会是什麽？这种情况说明什麽？

    由于酶的特性之一就是活性易受到其他物质的影响，如产物、底物或者是样品中的其他杂质，都可能影响着酶的活性。在酶的分离纯化过程中，随着杂质的减少，影响酶活性的物质随之越来越少，之前存在的抑制酶活性的物质很可能在某一纯化过程中被除去，所以出现酶活的得率超过100%的情况。这种情况说明酶的活性是很容易受到外界因素的影响的，所以在测定酶的活性时应该加以注意。

6.  有多种方法可区分高分子量的DNA与RNA分子，请写出一种最简便易行的生化分析方法，并说明理由。

    通过DNA酶处理待测样品，能够溶于酶液中的是DNA不能溶解的是RNA；或者通过RNA酶处理待测样品，能够溶于酶液的是RNA而不能溶解的是DNA。原因是酶具有专一性，DNA酶只能水解DNA而不能水解RNA而RNA酶恰好相反。

九．           参考文献

[1]生物化学实验指导  7-16   中国农业大学生物化学实验室  

中国农业大学自编教材

[2]艾志录等  不同品种小麦发芽过程中淀粉酶活力变化规律的研究 

中国粮油学报   20##年6月 第21卷第3期

[3]马永强等 玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究  食品科学   294~297，    2007, Vol. 28, No. 11

[4]百度百科http://baike.baidu.com

       

 

第二篇：实验二 淀粉酶活性测定预习报告

生物化学实验预习报告

实验二 酶活力测定方法的研究（1）

                ——淀粉酶活性的研究

一、研究背景

酶即由活细胞产生的一类有催化活性的生物大分子，大多数由蛋白质组成（少数为RNA），它是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。酶的催化具有高效性、专一性、可调节性以及需要温和的条件。酶的催化活性受外界条件的影响，如温度、pH、离子强度、激活剂、抑制剂等均会使酶活性发生改变。另外，酶在工业生产及生活中应用广泛，如酱油、食醋以及酿酒工业都需要酶的参与，洗衣粉加入酶增强去污能力等。酶活性的测定具有较强的实际意义，例如某些酶活性的变化可以引起特定的疾病，测定这些酶的活性可以作为疾病诊断的一个依据。

淀粉酶是水解淀粉糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为α-淀粉酶与β-淀粉酶等。休眠的种子中只有β-淀粉酶存在，而α-淀粉酶在种子萌发过程中才形成。测定淀粉酶的活性具有重要的意义，淀粉酶普遍存在于植物体内，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，其活性高低可以衡量种子萌发速率，也可以作为水稻抗逆性的生化指标（如干旱、盐、重金属胁迫）。本实验中我们通过学习经典的淀粉酶活力测定方法，分析具体的实验细节，从而获取酶活力测定的相关理念。

二、研究目标

1.掌握酶活力测定的一般思路与方法；

2.进一步熟练使用分光光度法测定物质浓度；

3.测定α-淀粉酶与β-淀粉酶的活性；

4.体会并掌握实验细节的设计与分析方法。

三、研究策略

两种淀粉酶的特性有所不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力（原因分析见思考题6）。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。另外，实验时分别设置对照组和测定组，从而排除无关变量的干扰。采用分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，从而表征出淀粉酶的活性。

四、研究方案及可行性分析

1.研究方案

（1）酶的获取

淀粉酶广泛存在于禾谷类的种子（特别是萌发后的种子）中，所以取萌发的小麦种子研磨浸提得到初始酶液。

（2）反应过程

α-淀粉酶耐高温，而β-淀粉酶在高温下易被钝化。可以在适当的高温下水浴处理，使β-淀粉酶失去活性的同时α-淀粉酶活性基本不受影响，与此同时，设置对照组以排除干扰因素（如萌发种子中产生的麦芽糖），对比测定组与对照组的差异，分解淀粉所得到的产物就可以认为是α-淀粉酶催化的产生，即可得到α-淀粉酶活力。另外，不做高温处理，在相同的测定条件下测量α-淀粉酶和β-淀粉酶的总活力，最终计算两者差值得到β-淀粉酶活力。

（3）产物检测（还原糖的3,5-二硝基水杨酸法）

淀粉水解产物为麦芽糖，在碱性条件下，麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），在一定范围内，麦芽糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，在520nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

（4）酶活力计算

酶活力的大小与所催化反应的产物生成速率成正比。规定淀粉酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（mg麦芽糖·min^-1·g^-1鲜重）。以分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，最终得到酶的活力。

2.可行性分析

就实验方案本身而言，利用两种酶的不同特性加以处理，钝化其一，测定另一种酶的活性，方案合理，简便易行，具有可操作性；实验材料（萌发小麦种子）可在实验室获得，所需各种试剂均为实验室常备试剂，温度控制可通过恒温水浴箱实现，分光光度计、离心机等仪器实验室都有，所用试管、研钵等器具实验室均可提供；实验所用时间约为3h（下文会粗略计算），可在规定时间内完成，故时间上有可行性。综合以上各点，本实验具有很大的可行性。

3.预期实验结果

α-淀粉酶与β-淀粉酶活力均可通过本实验测得。

五、具体实验设计

1.实验仪器及试剂

722型光栅分光光度计、托盘天平、离心机、恒温水浴锅、具塞刻度试管、50ml容量瓶、研钵、石英砂、微量可调手动移液器、1%淀粉溶液、蒸馏水、pH5.6的柠檬缓冲液、3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）、麦芽糖标准液（1mg/ml）、0.4MNaOH溶液、萌发的小麦种子

2.实验步骤

（1）初始酶液的制取（30min）

2g萌发的小麦种子→少量石英砂，研磨至匀浆→少量多次用蒸馏水转移到50ml容量瓶至40ml→颠倒浸提15~20min→定容至刻度→混匀→3500r/min离心20min→上清液

（2）α-淀粉酶活性的测定（50min）

（3）α-及β-淀粉酶总活性的测定（25min）

取所制取的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，定容至刻度，混合均匀得到稀释后酶液。

（4）麦芽糖含量的测定

A.标准曲线的制作（35min）

B.样品的测定（35min）

（5）计算公式

α-淀粉酶活性（mg麦芽糖·min^-1·g^-1鲜重）=[（A-A’）×样品稀释总体积]/[样品总重（g）×5min]；

（α-+β-）淀粉酶总活性（mg麦芽糖·min^-1·g^-1鲜重）=[（B-B’）×样品稀释总体积]/[样品总重（g）×5min]；

A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度

A’——α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度

B——α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度

B’——α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度

3.实验所需时间预计

所用时间共计约3h。

4.某些试剂与操作的作用

（1）1%淀粉溶液  淀粉酶的反应底物

（2）pH5.6的柠檬缓冲液  提供和维持淀粉酶反应的最适pH

（3）0.4MNaOH溶液  1使酶失去活性（对照组）；2为还原糖的3,5-二硝基水杨酸反应提供碱性环境；3使对照组与测定组的处理保持一致，降低实验无关变量所造成的误差

（4）3,5-二硝基水杨酸溶液  显色剂，与麦芽糖反应，通过颜色变化深浅反映出麦芽糖含量

（5）麦芽糖标准溶液（1mg/ml）  绘制标准曲线

（6）酶提取液70℃恒温水浴15min  使β-淀粉酶活性丧失而α-淀粉酶活性不受影响

（7）酶液40℃恒温水浴15min  在最适温度下，使酶的活性维持在最高状态

（8）淀粉溶液40℃预热 使底物的的温度与酶的最适温度相吻合，避免混合时温度发生变化导致酶的活性不在最高状态。

（9）酶与底物混合液40℃恒温水浴5min  最适温度下，酶具最大活性与底物以恒定初速度反应生成产物

（10）α-及β-淀粉酶总活性测定时酶液的稀释  总活性较高，分解淀粉速率较快，短时间内底物迅速减少，因而测定得到的便不是初速度，而稀释后降低酶的比活，便于测定

（11）产物与3,5-二硝基水杨酸沸水浴共热5min  使麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸在加热条件下充分反应，显色充分，生成有色物质的量及颜色稳定

（12）测定吸光度前溶液稀释至15ml  低浓度下分光光度法对待测物质浓度的测定更加准确

5.误差分析

本实验中容易产生误差的地方有以下几个：

（1）初始酶液的制取。为减小误差，应研磨充分，浸提充分，准确定容。

（2）进行钝化和保温这两步。因此，为了保证酶促反应时间的准确性，必须做到准确记录时间，尽量减小因各管保温时间不同而引起的误差，同时恒温水浴温度变化不应超过±0.5℃，以减少温度变化所引起的误差。

（3）显色的过程。显色需要加热15min，时间要严格控制，而且沸水浴的水位要高于试管中试剂的高度，因为显色程度与水温和加热时间有关系。

六、质疑及相关思考

1.酶活力测定时需要测反应的初速度，这就需要底物浓度要足够大且远远超过酶量，测定时间要在最初的几分钟内（底物转化量<5%）。在本实验中，底物为2ml1%的淀粉溶液，测定反应时间为5min，这两个标准是如何确定的？而这些标准是否真的满足酶活力测定的要求？

2.本实验α-淀粉酶活性测定时是在70℃恒温水浴15min，该条件下β-淀粉酶活性是否真的完全丧失，而α-淀粉酶活性是否完全不受影响？我想不能完全这么肯定，如果是这样的话，这些因素所带来的误差有多大？是不是可以忽略？

3.实验中显色时间控制为15min，我在其他资料上也看到有的将显色时间定为10min^[1]，我们知道，显色时间过短，待测物质未与显色剂充分反应，显色不充分，会使测定结果偏低；若显色时间过长，生成有色物质可能会由于不稳定而被分解，也会使测定结果偏低。那么本实验最恰当的显色时间到底应该确定为多少？

4.关于β-淀粉酶活性的计算上，我们分别测定了α-淀粉酶活性以及（α-+β-）淀粉酶总活性，用二者的差值作为β-淀粉酶活性。这个思路是否科学？因为我们不知道α-淀粉酶与β-淀粉酶之间是不是有协同之类的作用，也就是说当两者同时存在时可能会对彼此的活性产生影响，从而导致我们测量到的总活性并不是α-淀粉酶与β-淀粉酶各自单独存在时的活性之和。

七、思考题

1.酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？

首先应该从生物材料中提取要测定的目标酶，可以通过分离纯化技术或者直接钝化与目标酶催化反应有关的其他酶的活性；其次由于酶促反应速率可用单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示，但产物从无到有，浓度变化大，容易检测，故一般通过测定产物的生成量来计算酶的活力；最后要测定初速度，酶促反应进程曲线是双曲线，在最初数分钟的反应时间内产物的生成量才与时间成正比，因此只有初速度才能反映出酶的真实催化能力。

2.根据上述总体思路你认为在设计酶活力测定实验时，对结果可信性影响最大的是哪方面？为什么？在该项设计中要注意什么？

对结果可信性影响最大的就是测定的条件，即测定酶活力时必须在该酶的最适条件下进行。因为只有在最适条件下酶才具有最大的活性，我们才能够测得该酶所催化进行化学反应的最大反应速率。

在设计最适条件时，应该注意以下几个方面：1要选择合适的底物（专一性不强的酶或者催化可逆反应的酶），且底物浓度要足够高，使酶达到饱和状态；2选择合适的辅因子、活化剂、变构剂的种类及浓度；3反应混合液的最适温度、pH、缓冲液种类及浓度、离子强度等；4指示酶与辅助酶的种类和浓度（酶偶联法）；5其他影响酶活性的因素，如抑制剂、氧化剂、表面活性剂等。

3.淀粉酶和转氨酶的作用各自有什么特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时你认为主要应该有哪些针对性的考虑？

淀粉酶属于水解酶类，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等，水解α－1，4-糖苷键，根据其水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶等。转氨酶属于转移酶类，是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，参与氨基酸的合成与分解。转氨酶的种类很多，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。转氨酶的辅基是磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺，两者在转氨基反应中可互相变换。

在具体设计实验方案时，我们要保证在这两种酶分别在各自的最适条件下进行酶活力测定，需要考虑底物、温度、pH、辅因子等条件。

4.酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？

酶促反应的特点：1通过降低反应的活化能，使催化具有高效性；2催化的底物和产物具有高度的专一性；3反应受严格的调节，可以通过各种方式调节酶活性来控制反应的进行；4反应条件温和，通常能在常温、常压、中性pH下进行。

通过规定酶活力单位可定量表示酶催化效率即活性的大小。一个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，1min内能催化1μmol底物转化为产物所需的酶量，或是转化底物中1μmol有关基团的酶量。其规定特点是以酶促反应产物的生成速度来间接衡量和表征酶活性的大小。

5.以你们对相关知识的理解，试着分析一下禾谷类种子（如：小麦）萌发过程中的主要代谢特点及可能存在的代谢途径。

禾谷类种子在萌发早期由于吸胀作用，会使与代谢相关的一些酶类及细胞器得到活化，同时修复细胞内的生物膜系统和DNA。物质代谢的主要特点是贮藏器官发生贮藏物质分解，转化成可溶性物质运到胚部作为呼吸基质或者合成新细胞的材料，在这些过程中会发生淀粉、脂肪与蛋白质的分解及转化。以淀粉的代谢为例，β-淀粉酶主要存在于胚乳中，α-淀粉酶的产生则与赤霉素诱导有关，盾片及胚芽鞘产生赤霉素转运到糊粉层，诱导糊粉层合成α-淀粉酶，随后分泌到胚乳，胚乳水解产生的可溶性糖输送到生长部位，作为营养利用。此外，植酸、维生素、同工酶、DNA、RNA、矿物质等均参与代谢。而对于能量代谢，呼吸作用明显呈现出上升——下降——上升——下降四个阶段^[2]，种子活力越高、萌发时条件越好，ATP生成量就越多。

可能存在的代谢途径有氨基酸代谢、糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径。

6.众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化b-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？

若采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶活力，则需要将条件控制到pH3.6以下，这就需要使用缓冲液，那么就要考虑到缓冲液中的组分（如某些离子）有可能是所测酶的激活剂或者抑制剂，这样一来所测酶的活性就不准确了。另一方面，强酸性条件会催化淀粉的水解，导致我们测得的产物不全是由酶催化得到，所以就无法计算酶的活性。相比较而言，温度变量是容易控制的，而且高温对a-淀粉酶活性基本无影响，却对b-淀粉酶有较好的钝化作用，并且在测定过程中我们没有引入其他的影响因子。

这种设计思路说明一方面在选用缓冲液时我们要考虑到其组分的影响，另一方面在实验设计上，我们通常选用容易达到、引入影响因素少的方法来控制条件。

7.有人认为本实验中可以用对照管调分光光度计的100%T从而获知测定管的OD值，你的观点呢？为什麽？你认为本实验中设计的对照管与比色法测定物质含量实验中设计的空白管有何异同？

我认为不可以，因为空白管用于绘制标准曲线，它除了不含有麦芽糖之外，其他处理方式均应该与所测标准液一致，从而排除其他物质对光吸收的影响。而对照管中一方面可能会含有少量的麦芽糖，其处理方式与标准液也不一样，故不能够代替空白管调100%T。

对照管与测定管相比其区别在于0.4MNaOH加入顺序不一样，目的在于使淀粉酶失活，另外，对照管其他的处理方式与测定管一致，这样可以排除无关因素的干扰（如酶提取液中含有的少量萌发时产生的麦芽糖），使最终二者所测麦芽糖量的差异就是由于淀粉酶分解所造成的。在用比色法测定时，被测的都是液体，通常要测的是溶质吸光度，而溶剂也是有影响的，所以要设置空白组，以调节仪器100%T，从而排除特异性光吸收本体物质以外的其他干扰物（如显色剂等）对溶质吸光度的影响。设空白组时要注意整个测定过程中必须使用同一个空白液，不能更换，且每次测定都要调零调百。二者之间的相同点在于都是为了消除无关变量或者干扰物质的影响。

八、参考文献

[1]王福荣，唐景春.耐高温a-淀粉酶活力测定法的研究.食品与发酵工业[J].1995，02：27~30.

[2]黄先纬.小麦种子萌发的生理生化.国外农学——麦类作物[J].1984，04：18~21.