实验二  离体蛙心灌流实验

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一、  实验目的

1.学习离体器官（蛙心）灌流的方法。

2.观察理化因素对蛙心活动的影响。

二、  实验原理

蛙心的灌流:蛙心无营养性血管，离体之后采用人工灌流的方法，仍可保持其新陈代谢，心脏仍能有节律的自动收缩、舒张，并维持较长时间，心肌的营养是通过心脏内膜液体的直接渗透而得。

心肌：

1.任氏液：正常对照

   含有NaCl、CaCl₂、KCl、NaH₂PO₄、 Na₂HPO₄

   和蒸馏水，其电解质、晶体渗透压、pH值与蛙的组织液相近。

2.0.65%NaCl灌流：

3.2%CaCl₂灌流：

4.1%KCl灌流：

5.1:10000 E　灌流

6.1:10000 Ach灌流

7.心得安

 β₁受体阻断剂，抑制肾上腺素与β₁受体结合，使E不能发挥作用。

8.阿托品

M受体阻断剂，抑制Ach减慢心率，加速房室传导，增加心房收缩力。

三、  实验器材

离体蛙心

任氏液、l％KCl溶液、2％CaC1₂溶液、0.65%NaCl溶液、1:10000 肾上腺素、1:10000乙酰胆碱、心得安、阿托品

四、  实验步骤

五、  结果与分析

 

心率：34次/min

最大收缩力：2.5g

最小收缩力：1.1g

          图1   正常脉搏曲线

心率：35次/min

最大收缩力：1.6g

最小收缩力：1.1g                 

图2   0.65%NaCl灌流脉搏曲线

分析：细胞外液中Ca²⁺浓度降低，2期Ca²⁺内流减少，胞浆中Ca²⁺减少，心肌收缩力降低。

心率：38次/min

最大收缩力：3.5g

最小收缩力：1.1g

           

图3   2%CaCl₂灌流脉搏曲线

分析：心肌的舒缩活动与心肌肌浆中的钙离子浓度的高低有关。心肌肌浆网不发达，储钙能力差，易受细胞外钙离子浓度高低影响。细胞外液中Na⁺与Ca²⁺有竞争性抑制，细胞外液Ca²⁺浓度升高，细胞兴奋时内流Ca²⁺增加，心肌收缩力增强。慢反应细胞4期去极速度加快，心率增快。

心率：21次/min

最大收缩力：3.4g

最小收缩力：1.1g

图4   1%KCl灌流脉搏曲线

分析： K⁺与Ca²⁺在细胞膜上有竞争性抑制，细胞外液中K⁺浓度升高，K⁺抑制细胞膜对Ca²⁺转运，因此进入细胞内Ca²⁺降低，心肌的兴奋—收缩耦联作用减小，心肌收缩力减弱。

心率：35次/min

最大收缩力：3.5g

最小收缩力：0.9g

         

图5   肾上腺素灌流脉搏曲线

分析：肾上腺素与心肌细胞膜上的β₁受体结合，心肌细胞和肌浆网膜Ca²⁺通透性增强，肌浆中Ca²⁺浓度升高，心肌收缩力增强。而且肾上腺素使肌钙蛋白与钙离子亲和力下降，肌钙蛋白对钙离子的释放增强，肌浆网膜摄取钙离子的速度加快，钠-钙离子的交换增加，复极期向细胞外排出钙离子增多，心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显加强。

心率：34次/min

最大收缩力：2.5g

最小收缩力：1.1g

          图6   心得安+E灌流脉搏曲线

分析：心得安是β1受体阻断剂，能够抑制肾上腺素与β1受体结合，使E不能发挥作用，因此心率及心肌收缩力保持不变。

心率：33次/min

最大收缩力：2.5g

最小收缩力:1.1g

图7   乙酰胆碱灌流脉搏曲线

分析：乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M受体结合，心肌细胞膜K⁺通道的通透性增强，促进K⁺外流，动作电位期间Ca²⁺内流减少，心肌收缩力降低。同时乙酰胆碱可直接抑制Ca²⁺通道，导致Ca²⁺内流减少，心肌收缩力降低。

心率：34次/min

最大收缩力：2.5g

最小收缩力：1.1g

        

图8   阿托品+Ach灌流脉搏曲线

分析：阿托品是M受体阻断剂，能够抑制Ach减慢心率，加速房室传导，增加心房收缩力，因此心率及心肌收缩力保持不变。

六、  讨论

1.  为何常用离体蛙心，而不常用离体哺乳类动物心脏做心脏灌流实验？

蛙类的某些基本生命活动和生理功能与哺乳类动物有相似之处，它的离体组织、器官的生活条件比较简单，易于控制和掌握，来源丰富且价格低廉。离体蛙心不需要恒温和特殊的供氧设备，因此常被选作心脏灌流实验。而哺乳类心脏生活条件要求高，离体心脏灌流需要恒温环境，恒压或恒流灌流、供氧。实验影响因素多、设备多，心脏离体后存活时间较短。因此一般学生实验较少用哺乳类动物心脏做离体心脏灌流实验。

2.  离体蛙心为什么会节律性跳动？

把离体和脱离神经支配、体液因素影响的动物心脏保持在适宜的环境中，在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动，这是由于心脏的静脉窦能自动按一定的兴奋节律产生兴奋，并传导到心房和心室，引起整个心脏又节律的兴奋和收缩。静脉窦能产生节律性兴奋是由于其自律细胞在复极完毕后，立即开始自动的缓慢的去极化，使膜电位逐渐减小，当达到阈电位水平时，便爆发动作电位。

3.  蛙心插管插入心室时，是在心脏舒张期插入还是在心脏收缩期插入？为什么？

蛙心插管插入心室时，应在心缩期插入。这是因为主动脉开口处有半月瓣，当心室收缩时，半月瓣正好打开，此时主动脉与心室腔相通，插管容易顺势插入心室。而在心室舒张期，半月瓣处于关闭状态，对插管产生阻力，不利于插入，强行插入易损伤心肌组织。

4.  实验过程中，为什么必须保持蛙心插管内液面高度的恒定？液面过高过低会产生什么影响？

在实验中，蛙心插管内液面的高度发生变化，心脏收缩曲线会发生相应的变化。心肌缩短幅度和速度即受前负荷的影响，也受后负荷的制约。插管内液面高度所产生的压力，在心室舒张末期是作用于心肌的前负荷，这个前负荷决定了心肌在收缩之前的初长度。因此根据心肌 Starling 心肌定律，液面高度的变化将导致心肌收缩强度的改变。心室开始收缩时，插管内液体产生的压力又成为心肌收缩时承受的后负荷，后负荷改变会使心肌收缩的幅度和速度发生变化。

液面过高，心缩曲线幅度降低。过高的液面使心室前负荷超过最适前负荷，心肌收缩强度不在增加或下降。而过高的后负荷却使心肌缩短幅度和速度大大下降。液面过低，心室收缩曲线幅度也会降低，前负荷过小，导致心肌收缩强减小的效应比后负荷减小的效应要强。因此试验中选取一最适液面高度，并保持这一液面高度，以便取得较好的实验结果。

5.  任氏液为何能维持离体蛙心较长时间的跳动？怎样才能使离体蛙心存活时间长？

因为任氏液是常规的生理代用液。它的组成与体液相近，具有能维持生物体的正常生命活动的功能。它与体液等渗具有相同的PH值，并含有能量、营养物，而且含有生物体心肌波动所需要的离子，如：K+、Na+、Ca2+等，并且等浓度，故能维持蛙心较长时间的跳动。可以通过用与蛙体液相近的生理代用液来使蛙心长时间存活。

6.  蛙心灌流时，蛙心心肌以何种方式获得营养？

蛙心心肌可以通过扩散的方式从任氏液中获得葡萄糖，以维持心肌的能量供应，同时又可以通过产能长生ATP，进而参与主动运输过程，从而从任氏液中获得更多的离子或营养物质

7.  蛙心灌流实验中，为什么不能改变蛙心与换能器连线的张力？

改变蛙心与换能器连线的张力会影响蛙心收缩幅度，太紧心脏会停止，太松换能器反应不明显。

 

第二篇：生理学实验报告-蛙心灌流

实验名称：

蛙类离体心脏灌流

课程名称：     生理学实验       

指导教师：龙天澄张碧鱼陈笑霞

实验人：叶永锋   08344031    

学   院：     海洋学院         

实验时间：  2009年12月09日   

一、【目的要求】

1、学习斯氏离体蛙心灌流法。

2、了解心肌的生理特性。

3、观察Na⁺,K⁺,Ca²⁺及肾上腺素(Adr),乙酰胆碱(ACh)等对离体心脏活动的影响。

二、【原理】

将离体蛙心（失去神经支配的蛙心）保持在适宜的环境中，在一定的时间内仍然能够保持节律性收缩，心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，可以通过改变灌流液的某些成分，观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性，都与钠、钾及钙等离子有关。血钾浓度过高时（高于7.9mmol/L），心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩性都下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张期。血钙浓度升高时，心脏收缩力增强，过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低，心肌收缩力减弱。血中钠离子浓度的轻微变化，对心肌影响不明显，只有发生明显变化时，才会影响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强，乙酰胆碱则与肾上腺素的作用相反。

三、【实验仪器】

青蛙、 常用手术器械、蛙板(或蜡盘)、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夹、0．65％NaCl、5％NaCI、2％CaCl2、1％KCl、1：5 000肾上腺素、1：10 000乙酰肌碱、300U／mL肝素。

四、【方法与步骤】

1、斯氏蛙心插管法

（1）一只青蛙，双毁髓后背位置于蜡盘中，按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血管(见右图)。在左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎(动物个体小时，结扎位置可靠上些)。再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量(套管内2～3 cm高度)任氏液(内加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥(见右图)。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内(于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人套管，并使液面随心脏搏动而亡下移动，表明操作成功(否则需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧(不得漏液)，再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体(切勿损伤静脉窦)。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致(1.5～2 cm)，即可进行实验。

（2）将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉 (不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连（如右图）。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。

2、  实验观察

(1)记录正常心搏曲线

(2)改用0．65％NaCI溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线 氏插管装置出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2—3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致(以下同)。

观察可得，NaCI溶液会阻遏心脏搏动。

(3)向套管内加2～6滴5％NaCI(较细的套管需少加)溶液，作好加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变化。当曲线出现明显变化时，应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标※记，迅速用新鲜任氏液清洗2～3次，待心搏恢复正常。

(4)同法向套管内加入1～3滴2％CaCI：溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常(如果恢复迟缓，可多次冲洗)。

(5)向套管中加1—2滴1％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法更换灌流液，待心搏恢复正常。

(6)同法记录套管中加入l～2滴的肾上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。

(7)同法记录套管中加入1—2滴乙酰胆碱溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。

3、实验结果与分析

将记录到的各段心搏曲线附在实验报告中，计算给药前后曲线的频率、振幅和基线变化。测量结果填入表中。

五、【实验结果】

1、正常博击曲线图

2、滴加0.65%NaCl溶液图

分析：滴加0.65%NaCl溶液后，心跳减弱，这是由于用0.65%NaCl溶液灌注蛙心时，由于灌注液中缺乏Ca2+，以致心肌细胞动作电位2期内流Ca2+减少，细胞质Ca2+浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。

3、 滴加5%NaCl溶液

分析：由于细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。因此上图的心率变化与图2滴加0.65%NaCl溶液里变化并不是很大，两个不同浓度的相同溶液作用机理是一样的，在此一不作过多相同分析。但如果实验中滴加溶液顺序不一样，若先滴加5%NaCl.再滴加0.65%NaCl溶液，所得的心搏变化就不如图3那样明显了，收缩力仅出现很微弱的变化。

4、 滴加2%CaCl溶液

分析：细胞外Ca^2＋在细胞膜上对Na^＋内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca^2＋] ₀增高时，Na^＋内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca^2＋] ₀增高使Ca^2＋内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca^2＋内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca^2＋] ₀降低时，所引起的变化与高钙时相反。因此加入CaCl₂后，心率减少、振幅减少，基线上移。

5、 滴加1%KCl溶液

分析：滴加1％后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下降，最后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当细胞K+浓度增高时，K+与Ca2+有竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进入细胞内Ca2+减少，心肌的兴奋—收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。

6、 滴加1：10000肾上腺素溶液

分析：滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，描记的心搏曲线幅度明显增大。其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透性，导致肌浆中Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Ca2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加，提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度，刺激Na+与Ca2+交换，使复极期向细胞外排出Ca2+的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显增强。

7、 滴加1：10000乙酰胆碱溶液

分析：上图可示，蛙心收缩减弱，心率减慢，最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为：乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合，一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，将引起：1）窦房强细胞复极时K+外流增多，最大复极电位绝对值增大；Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房自律性降低，心率减慢。2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，Ca2+进入细胞内减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制Ca2+通道，减少Ca2+内流，进而使心肌收缩减弱。

表一：各测量结果比较

表 1改变灌流成分对蛙离体心脏活动的影响

六、【注意事项】

1.  制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。

2 .上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损，而且必须待心搏恢复正常后方能进行下一步实验。

3. 复习心肌生物电的产生机制及各种离子对心脏活动的影响。

4. 尽量选用健壮、体大的雄性蟾蜍，手术过程中注意保护心脏，避免损伤。

5. 实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。

6. 每次更换任氏液都必须保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量变化而影响结果。

7. 严格控制每次药品加入量，先加一滴，效果不明显再加一滴。

8. 滴加药品和换取正常任氏液，须及时标记，以便观察分析。

9. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管内溶液的吸管应区分专用，不可混淆使用，以免影响实验结果。

【思考题】

1. 离体蛙心制备好后，有时候馆内的液面上下移动很不明显，是何原因？如何处理？

答：离体蛙心制备好后，蛙心插管内的液体应随蛙心室的收缩和舒张活动而上下移动。其实质是：在心室收缩时，心室容积减少，室内压升高，将心室内的液体压入插管内，管内液面上升；在心室舒张的时候，心室容积增大，心室内压减少，将插管内液体吸入心室，管内液面下降。

但是有时候蛙心插管内液面波动不明显，其主要原因是：

⑴ 插管内尖端出现血凝块。插管内液体不能顺畅的进出心室腔内。解决方法为用长吸管将血凝块吸出，在吸出血凝块后，应立即用新鲜任氏液换洗插管内液体几次，直至蛙心颜色变淡，插管内无血液和小血块为止。

⑵ 插管尖端不在心室腔内，而是在心房或者脉间结缔组织等地方。解决方法为将插管重新插入心室，确定无误后，再结扎固定。

⑶ 插管进入心室腔内过深，以致尖端抵住了心室壁。解决方法为将插管稍稍外提，使插管口正好处于心室腔内，且开口正对着液体喷射的轴流方向。

⑷ 蛙心由于长期心肌失血，导致活力下降。解决方法为向插管内滴加少许肾上腺素或者对其进行外加力使其起搏，使其活动增强。

⑸ 房室传导阻滞。在插管的操作中，由于操作失误，对心脏造成的损害过大，最后导致房室传导阻滞。由于这种伤害是不可逆转的，所以必须改换蛙心重做实验。

2. 实验过程中，为什么必须保持蛙心插管内液面高度的恒定？液面过高或过低会产生怎样的影响？

答：在实验过程中，蛙心插管内液面高度发生变化，心脏收缩曲线会相应发生变化。心肌缩短幅度和速度受到前负荷和后负荷的影响。插管液面高度所产生的压力，在心室舒张期末期相当于心肌的前负荷，心室开始收缩的时候，此液体所产生的压力又成为心肌收缩时的后负荷。故高度的改变，进而引起的前后负荷的改变将改变心肌收缩的幅度和频率。

当液面过高时。心缩曲线幅度将降低。因为过高的液面，将使心室前负荷超过了最适前负荷，将导致粗细肌丝过于疏远，而导致收缩的潜力减少，心肌收缩不再增加或下降。而类似的，过高的后负荷，也使心肌收缩的幅度和速度大大下降。而当液面过低时，心室收缩的幅度也会减少。因为前负荷过小，将导致粗细肌丝过于接近，而导致收缩的潜力减少，实际上，此时由于前负荷的减少导致心室收缩的效力的减少比前负荷增加而导致的还有明显。类似的，后负荷相应的减少也会导致心室收缩的减弱。所以，在实验中保持最适的液面高度。是取得较好实验结果的前提。

3． 各种离子成分改变蛙心收缩的原理是什么？

答：由于心肌细胞生物电活动和收缩过程与离子密切相关，因此，细胞外液中离子浓度升高或降低均会影响到心肌的电生理特性和收缩性。

（1）钾离子的影响  K^＋与静息电位的形成有关。细胞外液K^＋浓度[K^＋]₀变化对心肌生理特性的影响较为复杂。高钾：[K^＋]₀轻度或中度增高时，膜内、外K^＋浓度差减小，静息电位绝对值减小，与阈电位差距缩短，因此，兴奋性增高。 [K^＋]₀显著升高时，由于静息电位绝对值减小过多（膜内达-55mV左右），Na＋通道失活，因而兴奋性降低甚至消失。另外，还使0期去极化速度和幅度减小，传导性降低，导致兴奋传导减慢，甚至传导阻滞。此外， [K^＋]₀增高还可提高膜对K^＋的通透性，加速K^＋外流，动作电位平台期缩短，因此，不应期缩短。此外由于平台期缩短，减少了Ca^2＋的内流，加上细胞外K^＋与Ca^2＋在膜上有竞争性抑制作用，导致心肌收缩功能减弱；

（2）钙离子的影响  细胞外Ca^2＋在细胞膜上对Na^＋内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca^2＋] ₀增高时，Na^＋内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca^2＋] ₀增高使Ca^2＋内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca^2＋内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca^2＋] ₀降低时，所引起的变化与高钙时相反。

（3）钠离子的影响  细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。只有当[Na^＋] ₀明显增高时，膜内外钠的浓度差梯度增大，因此，快反应细胞Na^＋内流加快，0期去极速度和幅度均增加，导致传导性和自律性增高。同时，Na^＋内流的增多促进细胞内Ca^2＋的外运使细胞内Ca^2＋浓度降低，因此，心肌收缩能力减弱。反之，当[Na^＋] ₀降低，使心肌传导性和自律性降低，心肌收缩能力增强。

八、【参考文献】

【1】项辉,龙天澄等. 生理学实验指南[M]. 科学出版社, 20## : 21- 38.

【2】朱大年.生理学[M].人民卫生出版社，2008：6-8.