蛙心灌流报告

蛙类离体心脏灌流

院系：生命科学学院实验人：张优 13941202 邓晓娟 13941201

（本次实验报告由张优执笔）

一、实验目的

1、学习斯氏离体蛙心灌流法。

2、了解心肌的生理特性。

3、观察Na⁺,K⁺,Ca²⁺及肾上腺素,乙酰胆碱对离体心脏活动的影响。

二、实验原理

（一）两栖类动物无冠状循环

两栖类动物无冠状循环，心肌直接从流经心腔的血流中获取营养。即心室肌直接从心室腔中获得营养。故用任氏液置换心室中的血液后，心室插管中的灌流液便成为心室肌的细胞外液。

（二）心肌对细胞外离子浓度和体液因数敏感

（三）钾、钙和钠离子对心肌特性的影响

1.血钾浓度过高时（高于7.9mmol/L），心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩性都下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张期。

2.血钙浓度升高时，心脏收缩力增强，过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低，心肌收缩力减弱。

3.钠离子浓度的轻微变化，对心肌影响不明显，只有发生明显变化时，才会影响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强，乙酰胆碱则与肾上腺素的作用相反。

三、实验材料

青蛙、常用手术器械、蜡盘、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、滴管、小烧杯、纱布、棉线、任氏液、蛙心套管、套管夹、0．65％NaCl、5％NaCI、2％CaCl2、1％KCl、1：5 000肾上腺素、1：10 000乙酰肌碱、300U／mL肝素。

四、实验步骤

（一）蛙心的解剖

1.毁脑毁脊髓

2.打开胸腔

3.剪开心包膜、暴露心脏

（二）斯氏蛙心插管法

1.结扎

左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎。左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。

2.插管

左主动脉结扎处下方用眼科剪剪一小切口，将盛有任氏液＋少量肝素的蛙心插管由此口插入主动脉，至动脉圆锥时约“向后向下向前”试插，当心室收缩时容易经主动脉瓣插入心室腔内。

3.心脏离体

稳定套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧，将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，使心脏离体。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致2 cm。

4.支架固定

将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。张力传感器与计算机采集系统相连。如右图。

（三）实验观察操作

（1）记录正常心搏曲线。

（2）将蛙心插管0.65％NaCl溶液全部进行灌流，液面高度不变，并作好标记，观察用简单的生理盐水取代任氏液后心脏活动的变化。待心搏曲线出现明显变化时，立即吸去插管中的灌流液，同时作好冲洗标记，并用正常、干净的任氏液清洗2～3次，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。

（3）在插管内正常任氏液的基础上，加入2滴5%NaCl溶液，作好加药标记，观察心搏曲线的频率及振幅的变化。当曲线出现明显变化时，立即吸去插管中的灌流液，用干净任氏液清洗3次，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。

（4）向插管内加入半滴2%CaCl2溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液（方法同上），清洗，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。

（5）向插管中加半滴1%KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，立即同法更换灌流液，清洗，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。

（6）同法记录插管中加入半滴1∶5000肾上腺素溶液后心搏曲线的变化。

（7）同法记录插管中加入半滴1∶10000乙酰胆碱溶液后心搏曲线的变化。

五、实验结果及分析

1、正常博击曲线图

2、滴加0.65%NaCl溶液图

滴加0.65%NaCl溶液后，心跳减弱，这是由于用0.65%NaCl溶液灌注蛙心时，由于灌注液中缺乏Ca2+，以致心肌细胞动作电位2期内流Ca2+减少，细胞质Ca2+浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。

3.滴加5%NaCl溶液

　　由于细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。因此上图的心率变化与滴加0.65%NaCl溶液里变化并不是很大，两个不同浓度的相同溶液作用机理是一样的。但如果实验中滴加溶液顺序不一样，若先滴加5%NaCl.再滴加0.65%NaCl溶液，所得的心搏变化就不如图3那样明显了，收缩力仅出现很微弱的变化。

4.滴加2%CaCl溶液

细胞外Ca²^＋在细胞膜上对Na^＋内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca²^＋]₀增高时，Na^＋内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca²^＋]₀增高使Ca²^＋内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca²^＋内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca²^＋]₀降低时，所引起的变化与高钙时相反。因此加入CaCl₂后，心率减少、振幅减少，基线上移。

5.滴加1%KCl溶液

滴加1％后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下降，最后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当细胞K+浓度增高时，K+与Ca2+有竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进入细胞内Ca2+减少，心肌的兴奋—收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。

6.滴加1：10000肾上腺素溶液

滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，描记的心搏曲线幅度明显增大。其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透性，导致肌浆中Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Ca2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加，提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度，刺激Na+与Ca2+交换，使复极期向细胞外排出Ca2+的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显增强。

7.滴加1：10000乙酰胆碱溶液

蛙心收缩减弱，心率减慢，最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为：乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合，一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，将引起：1）窦房强细胞复极时K+外流增多，最大复极电位绝对值增大；Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房自律性降低，心率减慢。2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，Ca2+进入细胞内减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制Ca2+通道，减少Ca2+内流，进而使心肌收缩减弱。

六、实验讨论

1.思考题:各种离子成分改变蛙心收缩的原理是什么？

答：由于心肌细胞生物电活动和收缩过程与离子密切相关，因此，细胞外液中离子浓度升高或降低均会影响到心肌的电生理特性和收缩性。

（1）钾离子的影响 K^＋与静息电位的形成有关。细胞外液K^＋浓度[K^＋]₀变化对心肌生理特性的影响较为复杂。高钾：[K^＋]₀轻度或中度增高时，膜内、外K^＋浓度差减小，静息电位绝对值减小，与阈电位差距缩短，因此，兴奋性增高。 [K^＋]₀显著升高时，由于静息电位绝对值减小过多（膜内达-55mV左右），Na＋通道失活，因而兴奋性降低甚至消失。另外，还使0期去极化速度和幅度减小，传导性降低，导致兴奋传导减慢，甚至传导阻滞。此外， [K^＋]₀增高还可提高膜对K^＋的通透性，加速K^＋外流，动作电位平台期缩短，因此，不应期缩短。此外由于平台期缩短，减少了Ca²^＋的内流，加上细胞外K^＋与Ca²^＋在膜上有竞争性抑制作用，导致心肌收缩功能减弱；

（2）钙离子的影响细胞外Ca²^＋在细胞膜上对Na^＋内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca²^＋]₀增高时，Na^＋内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca²^＋]₀增高使Ca²^＋内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca²^＋内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca²^＋]₀降低时，所引起的变化与高钙时相反。

（3）钠离子的影响细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。只有当[Na^＋]₀明显增高时，膜内外钠的浓度差梯度增大，因此，快反应细胞Na^＋内流加快，0期去极速度和幅度均增加，导致传导性和自律性增高。同时，Na^＋内流的增多促进细胞内Ca²^＋的外运使细胞内Ca²^＋浓度降低，因此，心肌收缩能力减弱。反之，当[Na^＋]₀降低，使心肌传导性和自律性降低，心肌收缩能力增强。

2.实验注意

1）. 制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。

2） .上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损，而且必须待心搏恢复正常后方能进行下一步实验。

3）. 复习心肌生物电的产生机制及各种离子对心脏活动的影响。

4.）尽量选用健壮、体大的雄性蟾蜍，手术过程中注意保护心脏，避免损伤。

5）. 实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。

6）. 每次更换任氏液都必须保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量变化而影响结果。

7）. 严格控制每次药品加入量，先加一滴，效果不明显再加一滴。

8）. 滴加药品和换取正常任氏液，须及时标记，以便观察分析。

9）. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管内溶液的吸管应区分专用，不可混淆使用，以免影响实验结果。

七、参考文献

【1】项辉,龙天澄等. 生理学实验指南[M]. 科学出版社, 20## : 21- 38.