病毒论文

检测H7亚型禽流感病毒的技术和方法

姓名：杨娜

专业：生物科学

年级：2011级

20xx年5月 时间：

检测H7亚型禽流感病毒的技术和方法 摘要:自20xx年以来，全球报道的人感染H7亚型禽流感病毒病例超过100人，波及荷兰、意大利、加拿大、美国以及英国等国家。人感染H7亚型禽流感病毒的临床表现由结膜炎至轻微的上呼吸道疾病，甚至是肺炎。由于从家禽中分离到的H7亚型流感病毒不断增加，H7亚型对禽是高致病性的。快速诊断和及时监测是流感防控的首要步骤和重要一环，本文列 举了近年高效的检测技术和方法。

关键词:H7亚型禽流感病毒;RT- PCR检测; RT-LAMP检测。

一、RT- PCR检测方法

参照GenBank 中已发表的H7 亚型禽流感病毒血凝素( HA)基因设计合成了一对预计扩增片段大小约为310bp 的引物。利用这对引物, 通过对RT- PCR 反应体系和反应条件的优化, 建立了针对H7 亚型禽流感的RT- PCR 检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明, 该方法敏感性高, 最低可检出100pg 的AIV- H7 的mRNA, 且应用该引物对新城疫病毒( NDV) 、传染性支气管炎病毒( IBV) 及其他亚型的流感病毒( H1、H3、H5、H9) 在相同反应条件下未扩增出任何片段, 具有较好的特异性。用所建立RT- PCR 方法检测发病鸡组织病料及咽、肛拭子, 检测结果与鸡胚病毒分离结果相比, 阳性符合率高达90.6%。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒AIV- H7 亚型毒株A/Duck/Guangdong/01/2003( H7N3) 及其他亚型( H1、H3 H5、H9) 的毒株。

1.1.2 非免疫鸡和鸡胚1 日龄非免疫鸡,9～11 日龄非免疫鸡胚。

1.1.3 主要试剂TRIzol Reagent, dNTPs (each 2.5mmol)、ReverseTranscriptase

XL( AMV)、核糖核酸酶抑制剂( PRI) 、随机引物randomprimer p (N)6、Ex Taq DNA 聚合酶、DNA MarkerDL2000其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照GenBank 中注册的基因组序列, 借助DNASTAR5.07 和Primer Premier5.0软件, 设计针对AIV- H7 的HA 基因部分片段的引物SN1( 5'-

TCTTCDTTCTATGCRGAGATGAA- 3') 和SN2( 5'-TRAARGTVACYGTGTCATTRG- 3') 。各引物设计完后送上海英骏生物有限公司合成, 用DEPC 处理过的去离子水稀释为20pmol/μL 备用。

1.2.2 总RNA 的抽提 按Trizol Reagent 抽提使用说明书进行。加入11.5μL DEPC 水 溶解RNA, 即得到病毒总RNA, 直接进行反转录或- 20℃保存备用。

1.2.3病毒基因组cDNA 第一链的合成( RT) 参照AMV 反转录酶使用说明书进行。反应体系为20μL反转录体系: 5 ×AMV Buffer 4μL, dNTPs (each2.5mmol)2μL, 随机引物(10pmol/μL)1μL 、PRI 0.5μL、AMV 1μL, 病毒RNA 抽提液11.5μL。42℃水浴1h 后反应产物置于- 20℃保存或直接PCR 扩增。

1.2.4PCR 扩增 在50μL 反应体系中加入以下组分: 10 ×Ex Taq Buffer 5μL, dNTPs 2μL, 20pmol/μL,SN1 和SN2 引物各1.5μL, cDNA 产物2μL ,Ex Taq聚合酶0.5μL, 用无菌去离子水加至总体积为50μL。混匀后置PCR 仪上执行以下程序: 94 ℃预变性1min; 然后94 ℃变性50min, 53℃退火40s, 72℃延伸40s, 运行30 个循环后于72℃后作用10min。反应结束后, 取3μL糖凝胶(含0.5μg/mL EB)进行电泳检测。

1.2.5 敏感性试验 将AIV- H7 尿囊液提取的RNA溶液在分光光度计上进行浓度测定后从

10- 1 至10- 6作10 倍连续稀释, 再作为模板加入该RT- PCR 反应体系中进行RT- PCR扩增，以检测其敏感。

1.2.6PCR 产物的测序鉴定 将1.2.5 中得到的PCR 产物纯化后连接到pMD18- T 载体上并转化感受态细胞TOP10, 经质粒PCR 筛选可疑重组质粒送上海英骏生物有限公司进行序列测定。 2 结果与分析

PCR 方法的特异性 将从A/Duck/Guangdong/01/2003 ( H7N3) 、H1、H3、H5、H9 亚型禽流感病毒尿囊液及阴性尿囊液提取的RNA 反转录后进行扩增, 只有毒株

A/Duck/Guangdong/01/2003( H7N3) 可扩出特异性条带。扩增产物大小约为300bp, 与预计的理论扩增长度相符合，其他毒株均未为见扩增带。

3讨论

这个技术是敏感、特异、快速的检测方法，可对活禽、禽产品等进行直接检测, 比起鸡胚病毒分离培养, 大大缩短了诊断的时间, 也可避免散毒的危险, 对我国建立快速的进出口检验检疫、禽流感的临床早期诊断、流行病学调查及发病机理研究等具有十分重要的意义。 二、RT-LAMP快速检测方法

根据UenBank中登录的H7亚型禽流感病毒(H7 AIV)血凝素基因序列，设计了一套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物，并以此套引物建立了一种基于反转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)技术的H7亚型禽流感病毒诊断方法。由于从家禽中

[1]分离到的H7亚型流感病毒不断增加，H7亚型对禽是高致病性的.结果显示，该方法对H7 AIV

RNA约最小检侧限为0. 1 pg，灵敏度高于普通一步法RT-PLR 100倍;全部反应可在1. 5 h内完成;在反应体系中添加Fluorescent Detection Reagent染料后，可通过肉眼观察无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试捡证明，该方法灵敏度高、特异性好、不需要昂贵仪器，能够作为H7亚型禽流感病毒的快速诊断方法。

[2] LＡＭＰ是由日本荣研公司发明的一种新型核酸检测技术，该方法通过设计４个引

物来识别６个位点和具有解链功能的ＤＮＡ聚合酶来实现核酸的扩增检测。该技术一经面世

[3][4][5][6]就受到广泛的应用，目前已被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等各个领域的检测研

[7][8][9][10][11][12][13]究。

１ 材料与方法

１．１ 病毒

禽流感病毒Ｈ１～Ｈ１５亚型特异性试验用的鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）、鸡马立克氏病病毒（ＭＤＶ）、鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）等。

１．２ 引物的设计与合成

分析了流感数据库中４５个Ｈ７亚型流感病毒ＨＡ基因序列和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室测定的２个Ｈ７亚型禽流感病毒ＨＡ序列，找出ＨＡ基因保守区，在保守区内设计引物。

１．３ 试剂与鸡胚

ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）和ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＲＮＡ ｇｅｎｔｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ系统和ＡｃｃｅｓｓＲＴ－ＰＣＲ系统、１０日龄ＳＰＦ鸡胚、６周龄

[14]ＳＰＦ鸡，所有ＳＰＦ鸡都在负压隔离器内饲养。

１．４ ＲＮＡ提取

取１．５ｍＬ ＤＥＰＣ处理过的离心管，加入待检样品１００μＬ，加３００μＬ变性液，继续加入３０μＬ ２ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠溶液（ｐＨ４．０）。反复颠倒离心管４～

５次，混合均匀；加入酚－氯仿－异戊醇混合液３００μＬ，小心混合离心管３～５次，再剧烈摇晃１０ｓ，置于冰上静止１５ｍｉｎ；１２ ０００ｒ／ｍｉｎ ４℃离心２０ｍｉｎ，小心转移上清于另一个干净的１．５ｍＬ离心管中；加入等体积的异丙醇，于－２０℃静止至少１０ｍｉｎ，沉淀ＲＮＡ。1２０００ｒ／ｍｉｎ ４℃离心１０ｍｉｎ；弃上清，加入７５０ｍＬ／Ｌ的冰乙醇，温和地反复颠倒离心管３～５次，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ ４℃离心５ｍｉｎ；弃上清，用滤纸吸干管壁余液，真空抽干或者３７℃烘干２０ｍｉｎ；加入１０μＬＤＥＰＣ处理水，溶解ＲＮＡ。进而根据反应条件进行体系的优化。 １．５ 特异性试验

利用ＲＴ－ＬＡＭＰ方法分别检测Ｈ１～Ｈ１５亚型禽流感标准参考毒株，检测不同亚型病毒之间是否存在假阳性结果。同时，检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡白

[15]血病病毒等７种禽病病原，以检验此ＲＴＬＡＭＰ方法的特异性。

１．６ 敏感性试验

对病毒含量为１００ｎｇ的Ｈ５ＡＩＶ的ＲＮＡ，１０倍稀释后用ＲＴ－ＬＡＭＰ和ＲＴ－ＰＣＲ方法进行平行检测，并用一步ＲＴ－ＰＣＲ方法同时进行扩增。

２ 结果

２.１ＬＡＭＰ反应体系的优化

参照日本荣研株式会社所生产的ＲＴ－ＬＡＭＰ试剂盒说明书，对ＲＴ－ＬＡＭＰ反应体系的引物浓度进行优化，建立了２５μＬ的反应体系。体系包括：Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ １２．５μＬ，ＦＩＰ ０．４μＬ，ＢＩＰ ０．４μＬ，Ｆ３０．５μＬ，Ｂ３ ０．５μＬ，ＬＦ ０．２μＬ，ＬＢ ０．２μＬ，Ｅｎｚｙｍｅｍｉｘ １μＬ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｙｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３．３μＬ，ＲＮＡ ５．０μＬ。反应参数为６２．５℃反应１ｈ，８０℃作用１０ｍｉｎ。

２．２ 特异性检测

收获的尿囊液的血凝价为７ｌｂ，病毒滴度为１×１０７．５ ＥＩＤ５０／ｍＬ。阳性棉拭子浸出液的病毒含量为１×１０４ ＥＩＤ５０／ｍＬ。

用ＲＴ－ＬＡＭＰ方法检测Ｈ１～Ｈ１５亚型禽流感病毒，结果只对Ｈ７亚型病毒呈现出绿扩增曲线，但从其他亚型病毒没有扩增到目的片段（结果见图２Ｂ），说明该方法不与其他亚型的ＡＩＶ发生非特异性反应。用它对鸡新城疫病毒等其他７种禽病病原进行检测，没有扩增出目的片段，表明该方法能特异性扩增Ｈ７亚型禽流感病毒。

３ 讨论

ＬＡＭＰ方法具有以下优点：无需额外的反转录步骤，且在恒温下实现核酸扩增；特异性高，采用６个引物来识别目的基因上的８个靶位点；扩增效率高，刚开始以６ｎ进行扩增；扩增速度快，可在３０～９０ｍｉｎ内获得结果；可产生大量扩增产物；还可以通过其副产物———白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果（若加入荧光染料则更易观察），无需电泳可肉眼观察扩增效果；使用酶混合物，可在恒温（６２．５℃）情况下，最长在１．５ｈ内实现反转录和核酸扩增。因此，ＬＡＭＰ具有快速、灵敏、特异、高效、简便、实用的特点，在基层实验室可进行操作色的荧光（见图２Ａ），且产生出特异的。

参考文献

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3[4]ＮＩＥ Ｘ Ｚ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＤＮＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ，２００５，８９ （６）：６０５－６１０．

3[3]ＩＭＡＩ Ｍ，ＮＩＮＯＭＩＹＡ Ａ，ＭＩＮＥＫＡＷＡ Ｈ，ｅｔ ａｌ．ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ Ｈ５ＲＴ－ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈ５ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，２４（４４／４６）：６６７９－６６８２．

3[6] ＭＯＲＩ Ｙ，ＮＡＧＡＭＩＮＥ Ｋ，ＴＯＭＩＴＡ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ

［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｅ，２００１，２８９（１）：１５０－１５４．

3[7]ＦＵＪＩＮＯ Ｍ，ＹＯＳＨＩＤＡ Ｎ，ＹＡＭＡＧＵＣＨＩ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００５，７６（３）：４０６－４１３．

3[8]ＭＯＲＩＹ，ＫＩＴＡＯ Ｍ，ＴＯＭＩＴＡ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙｏｆ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ［Ｊ］．ＪＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，５９（２）：１４５－１５７．

3[9]ＩＴＯ Ｍ，ＷＡＴＡＮＡＢＥ Ｍ，ＮＡＫＡＧＡＷＡ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇ

ｒａｐｈｙ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，１３５（２）：２７２－２７５．

3[10]ＯＫＡＦＵＪＩ Ｔ，ＹＯＳＨＩＤＡ Ｎ，ＦＵＪＩＮＯ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（４）：１６２５－１６３１．

3[11]ＰＯＯＮ Ｌ Ｌ，ＬＥＵＮＧ Ｃ Ｓ，ＣＨＡＮ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３（１）：４２７－４３０． 3[12]ＰＯＯＮ Ｌ Ｌ，ＬＥＵＮＧ Ｃ Ｓ，ＴＡＳＨＩＲＯ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｂｙ ａ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，２００４，５０（６）：１０５０－１０５２． 3[13] ＵＳＨＩＯ Ｍ，ＹＵＩ Ｉ，ＹＯＳＨＩＤＡ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ－Ａ，Ｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｖｅｒｓｅ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴＬＡＭＰ）［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００５，７７（１）：１２１－１２７．

3[14]ＣＵＲＴＴＳ Ｋ Ａ，ＲＵＤＯＬ ＰＨ Ｄ Ｌ，ＯＷＥＮ Ｓ Ｍ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ２１ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ２ｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，１５１（２）：２６４－２７０．

3[15]ＩＭＡＩ Ｍ，ＮＩＮＯＭＩＹＡ Ａ，ＭＩＮＥＫＡＷＡ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｆｉｕｅｎｚａ Ｈ５ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ

［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，１４１（２）：１７３－１８０．