细胞培养实验写报告内容

 1目的

2 原理

3材料与方法（操作步骤）

4实验结果

5结论或结果分析

 实验一  鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养

        实验二  滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）

实验三  Hep-2细胞的传代培养

实验四  VSV TCID₅₀滴定

实验五  干扰素活性（效价）的测定

    实验六  VSV中和试验（稀释血清固定病毒法）

实验二  鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养

一、目的

1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；

2、掌握活细胞的显微镜下观察；

3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。

二、原理

离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。                                                                                                                                            

三、材料（按2人/组的量发放）

四、操作步骤

1、在DMEM和Hank’s 液中分别无菌操作以1％的量加入双抗，吸出10～15mlHank’s 液至无菌平皿中备用；

2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳；

3、取出两只无菌平皿，并标记①和②，待用。

4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳；

5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平皿①中，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平皿②中，再充分洗涤；

6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm³的小块（约250次），此时体积约0.5ml；用Hank s’ 液洗涤两次。

7、按照10倍量加入0.25％胰蛋白酶，调节pH至约7.3～8.0（肉眼观为肉红色）盖上瓶塞，写好标记；

8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。消化停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很快聚集成团，表明细胞活力好。

9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用Hank’s 液小心洗涤2～3次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入DMEM液约5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。吸上清；重复操作3～4次，收集细胞上清。

10、（1）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％），将细胞密度调到约1×10⁶个/ml。

（2）经四层无菌纱布过滤后收集滤液，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％），将细胞密度调到约1×10⁶个/ml；

11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到2只细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生长面朝下，在非生长面上做好标记，包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓名等。

12、细胞统一置于本室指定的CO₂孵箱中培养。

13、24h后观察细胞生长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细胞生长状态良好。

实验三 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）

一、实验目的

掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。

二、实验原理

原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究。 病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。

三、实验材料（按2人/组的量发放）

四、操作步骤

1、上述原代成纤维细胞培养24h后，一旦细胞完全贴壁生长良好后，则轻弃培养上清，换上细胞维持液（含3％小牛血清的RPMI-1640），接种200TCID₅₀的VSV0.1ml，在细胞瓶上标记换液时间，接种病毒量。正常对照也按照上述方法换上维持液。

2、再继续培养，每间隔12～24h观察，直至全部细胞出现明显的病变，显微镜观察细胞脱落，圆缩，则可停止培养。

3、收集全班的病毒培养物于100ml无菌盐水瓶中，写好标记，置于－20℃冰箱充分冷冻后再置于4℃冰箱或室温下解冻，该过程称为冻融。反复冻融三次后，细胞膜破坏，释放出胞内病毒。低速离心，弃细胞碎片沉渣，收集上清即为病毒悬液。留样测定病毒的TCID₅₀。

五、实验结果

1、鸡胚原代成纤维细胞的显微镜下观察。

2、VSV攻击鸡胚原代成纤维细胞后，细胞病变效应（CPE）的观察。

3、病毒收获的方法。

实验四   Hep-2细胞的传代培养

一、目的

掌握细胞传代培养的方法及其应用。

二、原理

原代培养后由于细胞游出数量增加，细胞进行增殖，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代。

细胞培养传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

三、材料

四、操作步骤

1、将细胞生长面朝上轻轻倒掉上清，用PBS小心洗涤三次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。

2、用上述吸管吸取1ml VTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约3～5min。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。

3、加入少量DMEM液细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于Ep管中。

4、计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04％台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。计算细胞密度。用DMEM制备成1×10⁶/ml的细胞悬液，并按10％的量加入小牛血清。

5、将上述细胞悬液分装5ml到新细胞瓶中，塞好塞子，送培养箱培养，24h后观察。

以备实验五、六、七用。

实验五 VSV TCID₅₀滴定

（注：此实验和实验五、六同时进行）

一、目的

掌握病毒TCID₅₀滴定的基本原理和计算方法以及应用。

二、原理

多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathic effect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在细胞培养板孔或试管内引起半数细胞发生病变所需的病毒量定义为病毒的组织细胞感染指数（tissue culture infection dose，TCID₅₀）。     

 测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做10倍稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；VSV增殖也较快，因此，48h~72h也可以观察、染色、计算。

三、           材料与器材

四、           操作步骤

1、制备细胞：方法同实验五。一瓶细胞消化后加入8ml营养液即可制成所需细胞悬

液。密度约为1×10⁶/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40或96孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO₂孵育箱培养24h，形成单层，做病毒滴定用。

2、50%组织细胞感染量（TCID₅₀）测定

（a）稀释病毒液：取无菌小试管或青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维

持液2.7ml，然后向第一管加VSV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内

吸液0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，

反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10^-1，

10^-2，10^-3…10^-9。

（b）病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器

把各稀释度的VSV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，

每孔100μl。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置37℃，5%CO₂孵育箱中

孵育。

（c）结果观察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE，病

毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落现象。“-”表示细胞正常；“+”25%细胞产生病

变、圆缩、破碎脱落；“2+”50%细胞产生病变；“3+”75%细胞产生病变；“4+”

100%细胞产生病变。（实验时，观察24h~48h即可染色计算）

3、计算TCID₅₀参见下表：

表1  VSV在Hep-2细胞上的TCID₅₀结果记录

按表中，10^-3稀释的病变高于50%；10^-4稀释的病变低于50%；50%病变分布于10^-3与10^-4之间，计算公式如下：

             高于50%病变率-50%                 100-50

距离比例=                                    =             =0.67

           高于50%的病变率-低于50%的病变率     100-25

 即1个TCID₅₀=10^-3.67,查0.67的反对数为4.68,即病毒做4.68×10³倍稀释时取0.1ml接种细胞，即可使50%细胞产生病变.

附录:如何计算200个TCID₅₀？

4.38×10³÷200=23.4,将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID₅₀。

五、           计算

请计算提供的病毒的TCID₅₀。

六、写实验报告并计算给定的病毒的TCID₅₀。

附录3

一、关于50%终点法的计算（参见《病毒学检验》（李洪源）人民卫生出版社2007）

1）                Reed-Muench法计算CCID₅₀

举例如下：

  VSV在Hep-2细胞上的TCID₅₀结果记录

由上表可知该病毒的CCID50介于10^-4与10^-5两个稀释度之间，二稀释度之间的距离比例为：

       高于50%感染百分数-50%                           83-50

距离比例=－                                    ×lg稀释倍数=              =-0.767

    高于50%的感染百分数-低于50%的感染百分数            83-40

低稀释度的对数（高于50％的感染百分数）＝lg10^-4=-4

lgCCID50=高于50％的感染百分数的低稀释度的对数＋距离比例

        ＝（-4）＋（-0.767）＝－4.767≈-4.8

    因此该病毒的CCID50为10-4.8/0.1ml，也就是说，此病毒的10-4.8的浓度（即1：63000）按0.1ml接种一组细胞孔后，可使50%的细胞感染，即有50%病变的可能性。

2）Karber法计算

二、实验结果的观察（《病毒学检验》P55）

1、观察结果

    于培养后的不同时间，如18h、24h、36h等，在倒置显做镜下观察细胞病变情况。

    a）细胞病变程度表示法  通观整个“单层区”，权衡总的情况，以下列符号表示其病变程度：

 

b）记录结果  病毒引起细胞病变效应的滴度以半数细胞培养感染量（cell culture infectious dose，CCID₅₀）表示，即凡能使50%（半数）细胞出现病变的最高病毒稀释度，即为50%感染单位，简称CCID₅₀。有时也称其为半数组织培养感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）。细胞病变效应出现的时间，不同病毒不完全一样，以感染细胞的病变不再发展，而对照细胞仍然完好为准。

实验六 干扰素活性（效价）的测定

（注：此实验所需的细胞为实验四时传代培养所得）

一、目的

1、掌握微量细胞病变抑制法测定干扰素效价的基本步骤以及结果分析。

2、熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。

3、了解影响结果的常见因素。

二、基本原理

病毒或其他干扰素诱生剂作用于巨噬细胞、T细胞或成纤维细胞后，由细胞基因自身编码产生的具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的一类小分子糖肽，统称为干扰素。干扰素发挥重要的酶的特性而抑制病毒DNA和蛋白质的合成，从而抑制病毒在细胞内的增殖。因此具有间接的广谱抗病毒作用。

为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的测定。干扰素效价一般定义为：凡1ml干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的效价，即单位/毫升。

三、测定方法

   测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是“细胞病变抑制法”（Method of Cytopathic effect inhibition assay，简称CPE法）。此法的主要优点是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目前各实验室的常规。亦可用“放射化学测定法”、“染料摄入测定法”。本次实验也主要采用前法。下面就此法的发展做一简要阐述。

1、全量细胞病变抑制测定法

优点：操作简单、易于掌握、结果可靠

缺点：大量测定时，耗费细胞量太大，清洗工作量大，判断结果不能完全排出主观因素。

2、常规微量细胞病变抑制测定法

此法是在“全量法”基础上加以改良的一种方法，它的最大优点是：需用细胞量少，适于大量干扰素标本检测。其主要缺点是：判断结果不能完全排除主观因素。具体操作形式有：

先使细胞培养24～48h形成单层后，再加入不同稀释度的干扰素孵育24h，弃去，再加入100TCID₅₀的攻击病毒，继续孵育直至病毒对照出现完全病变为止。

主要特点是干扰素稀释标本和细胞同时加，优点是细胞对攻击病毒较敏感，且省时。两种方法滴定的干扰素效价无明显差别。

3、微量快速检测法（一步快速法)

本法的特点是干扰素（不同稀释倍数）、细胞（一定浓度）和病毒（一定量）三者同时加入。因为干扰素诱导细胞形成“抗病毒状态”要先于病毒的复制与成熟，即VSV的复制周期为7小时，而干扰素作用于靶细胞后约1小时即形成抗病毒状态。但一步快速法的敏感性随病毒攻击剂量的提高而迅速下降。因此常规微量法比微量快速法稳定。

四、材料准备

1、待测标本  为了除去非干扰素抑制物，待测标本应作（1）离心处理；（2）pH处理（此步学生不需做）。可分装为20～40μl /份/2人。

2、测定细胞  应根据“种属特异性”选择测定细胞。本实验室选用生长良好的一日龄或两日龄人羊膜单层细胞传代培养物(WISH)或人喉癌上皮细胞（Hep-2），本次实验选取后者。

3、攻击病毒  选用具有“同步致病作用”的VSV(Vesicular Stomatitis Virus)作为“攻击病毒”。使用前，应先在原代鸡胚成纤维细胞培养物（约400万细胞/毫升）中传代增殖及滴定病毒的空斑形成单位（PFU）或在人羊膜单层细胞上滴定其TCID₅₀。病毒的攻击量一般可选100~300个TCID₅₀（一般不得小于10个TCID50，不得大于500个TCID₅₀）。

4、胰蛋白酶混合消化液VTP，其胰蛋白酶和Versene的最终浓度分别为0.05和0.02。用VTP比单用胰蛋白酶作消化液对细胞的损伤要小些。

5、营养培养基  配方是（1）DMEM；（2）10%灭活小牛血清；（3）双抗。最后用NaHCO₃调pH至7.2~7.4。

6、微量细胞培养板  无菌40孔进口板1块/组。

7、CO₂培养装置  采用CO₂孵箱（CO₂为5%，空气为95%）。

8、其他器材：5ml吸管2只/组，1ml吸管1只/组，tip头1盒/桌。

五、操作步骤

1、稀释待检干扰素（在微量滴定板上直接进行）

（1）配制10％小牛血清的营养液5ml，除第一列外，在第一、二排的第2～10孔各加100μl营养液；

（2）将待检干扰素进行400倍稀释后，分别取100μL于第一孔和第二孔，将第二孔，充分吹吸3次，吸出100μl于第三孔，重复上述操作，直到第8孔，吹吸后弃去100μl。因此依据倍倍稀释原则对干扰素进行系列稀释，各孔的稀释倍数如下表所列。

第九孔为细胞对照孔，不加干扰素保护也不加病毒攻击；第十孔为病毒对照，不加干扰素保护加病毒攻击。第二排按照同样方法进行，即每个稀释度重复两孔。每孔含量为100μl。

2、微量单层细胞培养

（1）按常规方法将预先培养好的细胞单层用VTP消化下来;

（2）用营养培养基将细胞制成40万个细胞/毫升的悬液;

（3）用加样器向微量细胞培养板每孔中加入100μL细胞悬液（加时不断摇匀瓶中的细胞）;

（4）置CO₂孵箱中培养18~24h。

3、病毒攻击

观察到细胞单层良好时，将各孔内含干扰的培养液倒掉，于每孔中加入100TCID₅₀的攻击病毒VSV 100μl，该病毒用3％维持液稀释，细胞对照组加入等量的维持液。本组加入24小时引起75~100病变的VSV 100μl。置37℃孵育24～40小时。

4、观察结果

4.1 可直接倒置显微镜观察。在规定的时间内首先观察“细胞对照组”和“病毒对照组”，若病毒对照组各孔中的细胞出现75~100％的明显病变和死亡，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。否则弃去重做。每孔中出现的细胞病变（CPE）程度，用＋表示。一般病毒对照孔，出现+++或++++，干扰素保护孔CPE不再进展，则可终止反应，并染色。

4.2 结晶紫染色：将上述反应板取出，弃去孔内液体于消毒液中，每孔加入1滴染色液，3～5min后，弃去，洗净孔内残余液体，控干即可记录结果。细胞着色的深浅可以直观反应CPE出现的程度，一般＋＋＋＋时板孔内几乎无可见的细胞贴壁层，无CPE时则板孔内细胞贴壁层完整。

六、结果判断与计算分析
1、效价单位：效价以单位/毫升表示

一般判定法：凡1ml干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的单位/毫升。如某干扰素稀释到1：8000时仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”的损害，即出现＋＋的稀释度，则该干扰素的效价即为8000单位/毫升。

特殊计算法（通常按照Reed-Muench法计算）
 1计算保护百分比，见下表

A、B、C项为原始数据，

4＋表示全部细胞病变；3＋表示75％细胞病变；

2＋表示50％细胞病变；1＋表示25％细胞病变。

2求出干扰素单位

从上表中可大略看出，此批干扰素能保护半数（50％）细胞不被“攻击病毒”损害的最高稀释度在1：3200～1：6400之间。因此，可通过下式求出其距离比。

                高于50％的百分比－50              63－50

距离比＝                                      ＝           ＝0.52

          高于50％的百分比－低于50％的百分比      63－38

即此批干扰素稀释到2^－5.52  × 10^－2 （1:4588）时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”损害，其结果可记为5.52Log2+2单位/毫升（5.52Log2＋2 u. ml^－1）。

4、工作单位修正

各实验室所测得的干扰素单位，习惯上一般都称为该实验室“工作单位”。为了表明某种干扰素效价的高低，就必须用同型国际干扰素参考制剂加以修正。例如，当我们要修正本实验室所制备的兽用白细胞干扰素的效价时，就应当：

（1）查明兽用白细胞干扰素参考制剂的标准单位(R1)                                          

（2）并在相同条件下测出兽用白细胞干扰素参考制剂的工作单位（R2）

（3）测出本实验室所制兽用白细胞干扰素的工作单位(X2)

（4）按下式求出本室所制兽用白细胞干扰素的修正单位（X1）：

R1 : X1 = R2 : X2

例如设：R1=5000单位，  R2=10000单位， X2= 8000单位；

则按上式可求知：X1 = 4000单位。

实验七  VSV中和试验（稀释血清固定病毒法）

一、实验目的

测定血清中的VSV中和抗体效价

二、实验原理

特异的抗病毒免疫血清（中和抗体）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必须有一定效价的中和抗体。根据稀释成分不同可分为两种方法。一为固定病毒用量（100TCID₅₀）与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验，以血清中和抗体滴度表示。二为固定血清用量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。结果以中和指数表示。

三、实验材料

VSV免疫动物血清（S1、S3）、患者血清（S2）、100TCID₅₀ VSV病毒悬液、稀释液、40孔平底细胞板、Hep-2细胞一瓶、吸管、加样器等。

四、实验步骤

1、40孔板每孔加稀释液100μl，作好标记，按图进行。每块板做2个血清标本：S1、S2。

S对照   1:20    1:40     1:80    1:160   1:320    1:640   1:1280   C对照  V对照  

2、取1:10灭活血清，第一孔加入100μl，吹吸三次后吸出100μl加入第二孔，吹吸三次吸出100μl加入第三孔，依次直至第八孔，吸出100μl弃去。第九孔细胞对照，第十孔病毒对照均不加血清。

3、预先配好100TCID₅₀ VSV病毒悬液，按照每孔100μl加入， C对照及S对照（即第1、9孔）不加病毒，V对照加100TCID₅₀  100μl。最后每孔总量200μl，C对照及S对照补充稀释液100μl/孔。

4、37℃ 作用1小时。

5、利用此1小时制备Hep-2细胞悬液并加入上述混合液中。

Hep-2一瓶，PBS洗涤二次        VTP  1ml消化       约5min后倾去     37℃至细胞从玻璃瓶脱落      加营养液6ml，细胞计数，成1×10⁶/ml，每孔加100μl细胞悬液。37℃  CO₂孵育，48h观察结果。

六、           实验结果

用倒置显微镜观察。首先观察对照：V对照（+++～++++）；S对照（-/±）；C对照（-）。以病变作为指标，能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体的效价（滴度）