小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

【实验目的】

1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；

2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；

3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；

4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；

【实验原理】

1.      细胞培养

细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

2.      细胞死活鉴定

细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：

① 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。

② 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。

3.      血球计数板的使用

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm²，每个小方格的面积为1／400mm²，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm³，每个小方格的体积为l／4000mm³。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。

图1 血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）

【实验用品】

1.  材料

小鼠脾脏；

2.  试剂

PBS缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红；

3.  器材

解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管（上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好）；

倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。

【操作步骤】

A.     原代脾细胞培养

1、 取材：

取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。

2、分离脾细胞：

用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，以3000转/分离心1-2min。

3、 培养脾细胞：

从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃二氧化碳培养箱中培养。

B.      细胞死活鉴定

台盼蓝法：

1、 试剂配制：

用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。

2、 细胞悬液制备：

将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。

3、  染色制片：

取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。

4、  染色结果：

死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

C.      用血球计数板进行细胞计数

1、 染色计数：

取上述步骤二所制备0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜10´物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。

2、根据染色结果计算活细胞率：

依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：

【实验结果】

A.       细胞原代培养结果：

（观察时未照下培养结果，之后培养皿摇动导致细胞脱落无法观察到细胞。）

B.        细胞死活鉴定结果：

C.        细胞计数结果：

用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数区域的五个小方格，计数结果如下：

每个中格平均细胞总数为13

平均活细胞数为 8

活细胞率=活细胞数/细胞总数×100%=42/68×100%=61.8%

细胞密度=中格平均活细胞数×5×10000×稀释倍数

=8×5×10000×10

=4.0×10^6/ml

【注意事项】

1、 小鼠一定要将血放干净并且在酒精中充分浸泡3min，防止杂菌污染无菌操作台；

2、 为近一步保证无菌操作台的无菌环境，可在玻璃挡板口点一酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；

3、 取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散游离出来，也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；

4、 培养液PH为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况；

5、 生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分；

6、 倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。

 

第二篇：小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

陈素君

200900140007

实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。

实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。

要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。

细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000× 稀释倍数。

实验用品：

一、            器材

解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好

倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板

二、            试剂

PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝

三、            小白鼠

实验方法：

1. 细胞的原代培养

1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。

1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。

1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。

1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。

1.5取塑料培养皿一个，用“枪（1mL）”加入细胞培养液2mL，在盖上加标记后待用。用“枪（200μL）”吸取塑料皿中的培养液400μL，加入离心后并弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹散并混匀细胞，然后吸取200μL接种于上述塑料培养皿中，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

2. 原代细胞观察、死活鉴定及计数

2.1取出培养物，观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。

2.2取0.5mL细胞悬浊液于试管中，加1-2滴台盘蓝染液混合均匀，染色2min。

2.3将细胞悬液滴在计数器两边V字形槽内。细胞悬液依毛细作用扩散到计数区。在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量。（注意： 当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。）先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。计算细胞死亡率。

实验结果：

1.  细胞原代培养形态观察

原代培养后的培养皿呈粉红色，未出现异味，未被污染。在倒置相差显微镜下观察可看到聚集生长的细胞，形态不明显。计数时观察到游离的活细胞膜完整，形态多为近圆形，细胞质均匀。

2.  细胞计数

细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000× 稀释倍数

活细胞浓度（个/mL）=（20+18+11+17) /4*10000*1=1.65*10⁶

活细胞浓度（个/mL）=（11+10+5+10）/4*10000*1=9.00*10⁴

活细胞率=活细胞浓度/活细胞浓度*100%=54.54%

分析与总结：

1、取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散游离出来。

2、培养液PH为7.0~7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况。

3、生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分。

4、倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。