广东海洋大学学生实验报告书（学生用表）

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第二篇：园林植物组织培养考试资料

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3 植物组织培养

3.1定义

从植物体分离符合需要的器官、组织或细胞（含原生质体）等作为外植体，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养，使培养或操作对象表现生长发育等生命活动，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。

广义上是指所有类型的植物无菌培养技术

植物培养 胚胎培养 器官培养 组织培养 细胞培养 原生质体培养

狭义上，则指的是愈伤组织培养。即以植物外植体增殖而形成的愈伤组织为培养物的培养。这是因为绝大多数植物组织或器官均可在人为控制条件下诱导形成愈伤组织，而且几乎在所有植物离体培养过程中都伴有愈伤组织产生。

外植体：第一次用于接种的材料 初代培养: 外植体的最初培养

继代培养: 将初代培养获得的培养物移植到新培养基中，这种反复多次移植的培养称继代培养.

增殖率：每一次继代后所获得的培养物与继代前的比值。

固体培养: 加了琼脂等凝固剂于培养基中使之凝固. 液体培养

固液培养：先加固体培养基凝固后，再加液体培养基。

悬浮培养：培养物悬浮于液体培养基上.

愈伤组织: 是指在培养或自然条件下，植物细胞脱分化，不断增殖所产生的主要由薄壁细胞构成的不定形的组织. 脱分化：已分化静止的细胞开始分裂，改变原有细胞结构和功能，回复到无结构分生组织状态形成愈伤组织。

再分化: 从愈伤组织分化细胞团中再分化成完整植株。

不定芽：从非正常出芽的部位经诱导而长出的芽。 不定根：从非正常出根的部位经诱导而长出的根。

胚状体：组织培养中，培养细胞有时可以分化出具有胚芽、 胚根、 胚轴等类似于胚胎的结构，这种由愈伤组织不经过有性过程而直接诱导产生的类似胚的结构称胚状体。

3.2.植物组织培养的特点

主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。具体表现：

①培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、接种环境都须经过无菌处理。

②组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素，pH和渗透压也是人为设定的。培养的材料处于完全异养状态。

③培养的起始材料可以是植物的器官、组织、细胞、小孢子、胚乳、原生质体，它们都处于离体状态下，在组织培养条件下均能再生完整植株。

④培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆，或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根

⑤组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。容器内的相对湿度几乎是100 %，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。

⑥组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组织培养的成功也很重要。

4.研究类型和任务

5.植物组织培养的形成与发展

5.1 理论渊源 （1838-1902）

1667年，虎克发现细胞 1838年，施莱登提出植物细胞学说 1839年，施旺认为细胞学说也适用于动物

5.1 理论渊源 （1838-1902）

主要之点：细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体，同时，植物细胞又是在生理上、发育上具有潜在全能性的功能单位。正如施旺所说：如果具有存在于有机体内一样的条件，每个细胞应该可以独立生活和发展。

5.2 理论奠基及探索（1902-1933）

19xx年，哈布兰特(Haberlandt)根据细胞学说原理，提出了高等植物的组织和器官可以不断分割，直到单个细胞。

5.2 理论奠基及探索（1902-1933）

19xx年，德国植物胚胎学家汉宁用萝卜和辣根胚培养，长成小植株，这是离体培养的第一个成功例子。

19xx年，李继侗将3mm以上的银杏胚培养成功，同时发现胚乳提取物促进离体胚的生长。

5.3 组培技术建立（1933-1943） 19xx年美国的White等用番茄根尖的组织培养，首次建立了活跃生长的无性繁殖系．19xx年，White又发现B族维生素和吲哚乙酸，对离体根的生长有重要作用．他最早设计出适于植物组织培养的合成培养基配方。培养基是无机盐、糖类和酵母提取物。

5.3 组培技术建立（1933-1943）Gautheret 19xx年培养山毛柳、黑杨的形成层时，可以不断地增长几个月。这项技术的关键是使用了固体培养基。 1937-19xx年他在培养基中加入IAA和维生素B等物质，结果使柳树形成层的生长大为增加。 法国的另一位学者Nobecourt(1937-1938)培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，也使细胞增殖获得成功．

由于White, Gautheret和Nobecourt等科学家杰出的工作和发现，初步建立起植物离体培养的基本方法。

5.4 植物组织培养物的形态发生研究阶段

19xx年，Overbeek等以椰子汁作为培养基附加物，使曼陀罗心形期幼胚培养成功。

19xx年，罗士韦将菟丝子茎尖培养成功并在试管内开花，离体培养技术可以控制花芽形成。

1

19xx年，Skoog和崔瀓在烟草茎切断和髓培养研究中发现腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素对芽的抑制作用，并使烟草茎切断诱导形成芽，从而发现了Ad/IAA的比例是控制芽和根分化的决定性因素之一。 高——形成芽， 低—— 形成根。

19xx年，Muir将万寿菊和烟草的愈伤组织，转移到液体培养基中，放在往复式摇床上振荡，获得由单细胞或细胞聚集体组成的细胞悬浮液，而且可以继代繁殖，这是培养方式的突破。

19xx年，Miller发现激动素 激动素/生长素（提出植物形态发生调控的激素平衡理论：在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。）

19xx年，Steward把胡萝卜根韧皮部细胞悬浮培养，从中诱导出胚状体并使其发育成小植株，印证了细胞全能性。是人类第一次实现人工体细胞胚，为组培第一个突破。 19xx年，德国Gautheret 《植物组织培养原理和实践》一书，全面论述了植物组织培养，由于控制分化的需要对培养基、激素、营养条件、培养方法进行了大量研究。MS：1962、White：1963 、 B5：1968、 Ls：1965、 N6：1974等，也创立了多种植物培养方法。

19xx年，英国Cocking用纤维素酶和果胶酶溶解番茄根尖的细胞壁，得到原生质体，继续培养原生质体，可重新长壁、分裂分化形成根和芽，最终形成植物体。开创了植物原生质体培养和体细胞杂交工作。为组培第二个突破。

19xx年，Kanata、Rangas Wamy和Mahshwari培养婴粟未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，成功地获得能正常发芽的种子。 19xx年Morel培养兰花茎尖，脱毒快繁兰花。建立了“兰花工业” 。

19xx年Guha培养毛叶曼陀罗花药，得到由花粉发育来的单倍体植株。

19xx年Kameya和Hinata用悬滴法培养甘兰×芥兰杂种一代成熟花粉获得单倍体植株。

19xx年 Takebe 烟草叶肉细胞原生质体植株。

5.5迅速发展和应用研究 （1972―今)

先后在花药培养及单倍体育种、原生质体培养、植株再生、原生质体融合、体细胞杂交上取得大量成果。

19xx年Carlson在培养两个不同种的粉蓝烟草和郎氏烟草原生质体时，加入诱导剂（甘露醇、盐类），使两种原生质体发生融合，得到了体细胞杂种，而且该细胞杂种经细胞分裂分化形成完整杂种植物。

由于在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平、体细胞水平、杂种细胞水平均获完整植株，充分证实了细胞全能性。

19xx年，Bonne和Eriksson成功地完成了细胞器（叶绿体）的摄入。将具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体，在聚乙二醇诱导下融合成功。观察到16%的活胡萝卜原生质体中，含1至多个叶绿体。试验证明原生质体是引入外源遗传物质的极好材料。19xx年，Kao等发现PEG可促进原生质体凝聚并高频率融合，使大规模细胞融合成为可能．

19xx年，Melchers等首次获得了番茄和马铃薯属间体细胞杂种一Potamato.这个体细胞杂种的获得，激起人们对于远缘杂种的热情和想象力。“地面结番茄，地下长土豆”一度成为美谈，甚至有人想象叶肉细胞和牛乳腺细胞的融合――同时生产糖类物质和蛋白质！ 19xx年，在烟草冠瘿瘤培养物中发现了来源于农杆菌的Ti质粒，它可以自发地整合到植物的基因组中去，由此开始了植物重组DNA和基因工程的研究。近20年来，细胞工程技术被广泛用于植物的基因转化，于是细胞工程和基因工程紧密结合，构成了现代植物生物技术的主体。

19xx年，Larkin和Scowcroft评述了大量的组织培养文献后指出，再生植株中变异株的出现是一种普遍的现象。由组织培养诱发的变异叫做体细胞无性系变异，由此产生的变异株叫做细胞突变体。利用无性系变异，经过离体或田间筛选获得有用的细胞突变体，是一种新的细胞工程育种途径。 植物细胞大量培养生产有用的次生代谢产物是植物细胞工程另一个重要的领域。

6.应用及展望

6.1植物离体快繁 植物离体快繁是植物组织培养在生产上应用最广泛、产生较大经济效益的一项技术，特点是繁殖系数大、周年生产、繁殖速度快、苗木整齐一致等 对繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”的作物品种、脱毒苗、新育成、新引进、稀缺品种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快繁，以比常规方法快数万倍到数百万倍的速度进行扩大增殖，及时提供大量优质种苗或种薯。试管苗在国际市场上已形成产业化。

6.2无病毒苗木培育 很多农作物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等，病毒在体内积累，影响生长和产量，对生产造成极大损失。但是，感病植株并非每个部位都带有病毒， White早在19xx年就发现，植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生植株就可脱除病毒，获得脱病毒小苗。 由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此若是使用未受侵染或侵染程度较轻个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。 如果在一个品种中，并非全部母株都受到侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的营养体部分把病原菌消除，并由这些组织中再生出完整的植株。 病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。在较老组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能逃避病毒的侵染，可能的原因是： ①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖； ②在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制； ③倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，分生组织不受侵染；④在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。⑤已知病毒是DNA大分子，病毒DNA随植物细胞分裂而复制。细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在细胞伸长期间，是病毒核蛋白合成占优势。生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞。分裂速度比病毒DNA复制速度 2

快，故采用旺盛分裂的生长锥离体培养，可能脱除病毒。

“无病毒”：带有“特定无病毒”的涵义。

6.3培育新品种或创制新物种

6.3.1培育远缘杂种 受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种；通过原生质体融合，可以克服有性杂交不亲和性，从而获得体细胞杂种，创制出新物种或新类型。

6.3.2离体选择突变体 培养细胞处在分裂状态，易受培养条件和诱变因素影响产生变异，可以筛选出对人类有用的突变体，育成新品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时，由于处理细胞数远远多于处理个体数，因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来。

6.3.3单倍体育种 由于具有所有基因均能表现、基因型可快速纯合等优点。

5.3.4次生代谢物生产 利用组织细胞的大规模培养，生产天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。 对于人类来说，植物次生代谢产物是药物和工业原料的重要来源。长期以来，为了取得这些产物，人们大量采挖资源植物，造成许多稀有野生资源植物的短缺，甚至威胁到物种的生存。即使栽培资源植物，也需要占用耕地，而且受到地域和气候的限制。植物细胞离体培养成功不久，人们就试图利用细胞大量培养的方法来生产次生代谢产物。

6.3.5植物种质资源的离体保存

6.3.6人工种子 人工种子：植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。

意义：①人工种子结构完整,体积小,便于贮藏与运输,可直接播种和机械化操作；②不受季节和环境限制，胚状体数量多、繁殖快、利于工厂化生产 ③利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；④可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质；⑤体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。

7.国内外微繁概况

第一章 实验室及基本设备

实验室包括:准备室(化学实验室：洗涤、培养基配制、灭菌)、无菌操作室（带缓冲间）、培养室、鉴定室（细胞学实验室）和温室。 有无菌操作设备、培养设备、药品贮存、配制仪器设备及观察分析仪器设备等。 植物组织培养的基本操作包括：各种玻璃器皿的洗涤、灭菌；培养基的配制、灭菌；无菌室的消毒及接种操作。影响外植体生长和分化因子：物理环境（温度、光照和湿度）；化学环境（培养基组成、pH和渗透压），生物环境（外植体种类、大小、细胞密度）。

1.1实验室设计原则 满足能进行无菌操作和无菌培养需要,首先具有一定的无菌环境（无菌室，无菌箱，超净台）。使用无菌的容器和用具，进行无菌操作。然后把被培养的植物材料，放在一定的温度,光照，RH，营养条件下，使其生长，发育，繁殖。 设计原则（1）为减少污染，组培室最好设走道,人从外面进入，先通过一缓冲走道。（2）培养室应建在房屋南面，南、东或西应有大窗尽量利用自然光。（3）培养室房间宜小,门也宜小,最好为滑门,以保温节能.接种室房间也宜小,备有准备小间,以更换衣帽等,超净台较宽,门应稍大, 装紫外线灯.

1.3设备

2器皿的选择与清洗

2.1配制培养基需要的器皿 2.2细胞组织培养用的器皿

2.3玻璃器皿的清洗 一般用洗涤剂溶液清洗即可。 清洗用过的、装有培养物的器皿时，先除去残余的培养基或大块的残渣，用自来水冲洗一次后再用洗涤剂溶液浸泡。然后用试管刷把器皿壁内外刷洗干净，用自来水冲洗数遍，最后用蒸馏水过一遍，晾干后即可。

2.3玻璃器皿的清洗 吸量管和容量瓶用洗涤剂和自来水冲洗、晾干，再浸入硫酸加重铬酸钾洗液内浸泡几小时，在自来水中冲洗干净后再用蒸馏水冲洗１-3遍，稍晾一会儿，待不滴水珠时，即可放入烤箱烘干备用

3 培养基的配制

3.1培养基种类

由功能划分：（1）分化培养基:用于诱导愈伤组织形成和器官分化。加入一定浓度2，4-D

（2）增殖培养基:用于愈伤组织或芽增殖（3）生根培养基:用于分化芽生根，加入少量生长素，基本培养基浓度减半。

根据培养基的成分和浓度分： ①含盐量较高的培养基 特点：无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富。元素平衡较好，缓冲性能好。微量元素和有机成分含量齐全且较丰富。 MS、LS、BL、ER等。

②硝酸钾含量较高的培养基 有B5, N6, SH等。特点是培养基的盐类浓度较高，铵态氮含量较低，但VB1和硝酸钾含量较高。 ③中等无机盐含量的培养基 有Nitsch 、Miller 、H 等。特点是大量元素含量约为MS的一半，微量元素种类少但含量较高，V种类较多。 ④低无机盐含量的培养基 包括怀特、WS、HE等。特点是无机盐含量非常低，为MS的1/4左右，有机成分也很低。

3.2培养基特点 3.3培养基成分与作用

3.3.1大量元素 >0.5 mmol/l C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg

作用:①组成各种化合物，参与机体建造②构成特殊生理活性物质，参与活跃新陈代谢。③元素间互相协调，以维持离子浓度的平衡。④影响形态发生和组织器官建成

糖：a 调节培养基渗透压；b 作为碳源和能源；c 较高浓度糖防止幼胚早熟萌发

3.3.2微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl

3.3.3铁盐 细胞分裂与伸长，少铁细胞分裂停止

3

3.3.4有机成分：多数植物细胞在培养时都能合成所需的V，但合成数量不足

肌醇 ：肌醇本身并不促进外植体生长，但有助于活性物质发挥作用，提高VB1的效果，促进外植体生长，胚状体及芽形成。 Adenine （腺嘌呤）及其硫酸盐,促进芽的形成和生长.Ad是合成细胞分裂素前体之一.

椰子汁（10％），乳熟期玉米浆，荸荠汁，麦芽提取物，番茄汁（5-10％），香蕉泥（100-200mg/L）：提供一些必要的营养成分，生理活性物质和生长激素等

3.3.5琼脂 固化剂，琼脂加量与培养基硬度呈线性关系，降低细胞分裂素的活性.

优点:操作简便，对培养物支持，通气易解决.便于经常观察研究.

缺点：

用量、离子浓度降低、长时间高温、过酸过碱、加入吸附剂（活性炭）等会使凝固力下降.

3.3.6植物激素

生长素类 ：用于诱导细胞分裂、根的分化、诱导愈伤组织形成, 胚状体产生以及生根,配合一定细胞分裂素诱导腋芽及不定芽发生与生长 2,4-D >NAA, IBA>IAA设IAA为活性1,则NAA:3-4, 2.4-D:10-20,

细胞分裂素：促进细胞分裂和器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成，抑制顶端优势，促进侧芽生长

3.3.7pH值3.3.8其它成分

活性炭（AC） AC防植物组织自身酚类物质排泌和变褐老化，对形态发生和器官形成有良好效应。AC具有强大吸附能力，主要吸附非极性物质和色素大分子，减少一些有害物质影响，但吸附选择性差。

抗生素 ：防菌类污染，减少培养材料损失，但其对植物组织生长也有抑制作用

3.4母液的配制

为了避免每次配制培养基都要称量各种化学药品，常常把培养基中必需的一些化学药品，按原量的浓度增大10倍、100倍或1000倍后称量，配成一种浓缩液，这种浓缩液就叫做母液

母液配制程序A.准备蒸馏水、药品、容器等，确定扩大倍数、定容体积

B.清洁容器、称量药品C.分别溶解D.混合定容E.贴标签（药品名称及重量、扩大倍数定容体积、配制人、日期）

3.5培养基的配制程序

3.5.1.高温消毒的培养基

确定配方及配制数量，准备母液及培养瓶

①称量琼脂，加水到培养基最终容积的2/3-3/4, 加热煮沸溶解。

②吸取母液：根据配方要求，按顺序用量筒或移液管吸取大量元素、微量元素、铁盐、维生素、植物激素等各种母液，放在干净的烧杯中。③定容调pH值：把母液、糖，倒入煮好的琼脂中定容，混匀，用0.1 N NaOH或HCl调pH，一般为5.6-5.8. ④分装：把培养基分到所选用的培养容器中。⑤盖瓶盖：将培养瓶用瓶盖盖上拧紧。

⑥灭菌：高压灭菌锅先加水，放入培养瓶，开电，0.07MPa时排气到0， 0.11MPa （121℃）计时，维持在0.11-0.12MPa之间20min. 排气到0后取出培养基，冷却备用。

培养基高压蒸汽灭菌注意事项 ①装锅不可过满，需使锅内具有一定空间，便于热蒸汽的上下回流，才能收到良好灭菌效果。 ②锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽然达到规定压力，但由于锅内冷空气的存在，达不到相应的温度，影响灭菌效果. ③锅内达到一定压力后，注意在保持压力的过程中，严格遵守时间。时间过长会使培养基内一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分；时间不足则达不到灭菌效果

3.5.2.过滤消毒的培养基 过滤消毒是用过滤消毒器完成的。在过滤器的漏斗和接收瓶之间安装孔径为0. 45μm或0. 22μm的微孔滤纸，当与抽气泵连接并减压时，培养液通过微孔滤纸，但是培养液中的微生物因体积大于微孔而无法通过滤膜 4材料器械的消毒与无菌操作

4.1植物材料的消毒

4.2外植体的选择和处理

4.2.1外植体的选择原则 ①再生能力强②遗传稳定性好③外植体来源丰富④外植体灭菌容易

4.2.2常用的外植体

①茎尖②节间部③叶和叶柄④鳞片⑤其他

4.2.3外植体的灭菌

灭菌要求：既要把材料表面和内部的菌消灭,又不损伤或轻微损伤材料,不影响生长。

灭菌剂要求：既要有良好的灭菌效果，又容易除去，不影响材料生长。

4.2.3.3植物材料灭菌的过程

①材料前处理。从田间取回的材料，用自来水冲洗10min，洗去泥土等污垢，剪去残伤部分，再用自来水冲洗数次，剪成小段 ②灭菌剂配制。开启超净工作台，配制70％酒精、次氯酸钠、氯化汞等灭菌剂。为使灭菌剂湿润整个组织，还需在药液中加入数滴（浓度小于0.１％）表面活性剂吐温20或吐温80。

准备无菌杯、无菌水。

③材料灭菌。把材料放入70％酒精中，进行表面消毒。取出后立即放入灭菌剂中。数分钟后取出，放入无菌水中冲洗3--5次。然后，将材料放到无菌培养皿中待接种时使用。如果材料所带杂菌较少，酒精消毒的步骤可省略。

操作中所用的镊子、解剖刀、滤纸等，均需高压灭菌。镊子等器具在使用时，还要随时用酒精灯消毒

4.3器械的消毒玻璃培养容器常常与培养基一起灭菌

4

各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针和小铲子等，先在90％酒精中浸一下，然后在火焰上灼烧，待冷却后使用

4.4无菌操作的步骤1）无菌操作室（接种室）长期停用后再用时，需进行熏蒸灭菌。每次使用前用紫外线灯照射15-20 min，进行室内空气灭菌。同时将工作服、口罩等物品一起照射灭菌。

(2)接种台灭菌：超净台，每次接种前，先用紫线灯照射或用70%-75%酒精喷雾灭菌，然后使超净台正常送风30-40 min后再接种。接种箱每次使用前必须坚持熏蒸灭菌。 (3)工作人员操作前，先用肥皂洗涤双手，穿好工作服，戴好工作帽，用70％-75％酒精拭擦台面及双手。一应接种器械，均沾以70%-75%酒精，在酒精灯上严格烧灼灭菌。灭菌后的器械，在接种前严禁再度污染。操作时尽量不要讲话，防喷沫造成污染。(4)接种打开瓶盖时，注意不要污染瓶口。打开瓶盖和盖瓶盖前，坚持瓶口烧灼灭菌。操作时注意手臂切勿从培养基、无菌材料、接种器械上方经过，以免引起再度污染。

4.5污染源及其表现特征

4.5.1污染物种类 细菌、真菌

①细菌污染 在培养过程中，在培养基表面或材料表面出现沾液状物体、菌落或混浊的水迹状，泡沫发酵状等，其中又以乳白色芽孢杆菌最严重，它多数分布在培养基内部,偶尔出现在培养基表面,这种芽孢杆菌能耐一定高温、高压，对消毒剂和紫外线也有一定抗性,多在培养基灭菌后2-3d发生

②真菌污染 污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种3d甚至半个月后才出现。继而很快出现黑、白、黄、绿等孢子。真菌污染的原因多为外植体本身带菌、周围环境不清洁、超净工作台过滤装置失效、培养器皿口径过大等

4.5.2污染产生原因及克服

环境不洁、培养基和培养材料消毒不彻底、操作过程中不慎、操作人员或工具带菌等引起。

333①接种室消毒： 甲醛(2-10ml/m)和KMnO4(1-5g/m)熏蒸消毒(培养室用乙二醇6ml/m熏蒸消毒以避免甲醛使培养物中毒死亡)，

使用前用75%酒精喷雾降尘，打开超净台15~20分钟，用75%酒精擦净超净台工作区域，接种完壁后，用2%新洁尔灭擦超净台

3台面和地板,并开启紫外灯(距地2m,15-30w/6-9m)杀菌30min。

②培养基和接种用具的消毒

③培养材料选择与灭菌 通常多年生木本材料比一二年生草本材料带菌多；老材料比幼嫩材料带菌多；田间材料比温室材料带菌多；带泥土材料比清洁材料带菌多；晴天取材比雨天取材可降低污染率。对木本植物，可采用多次灭菌或多种药液、多次灭菌的方法来增强效果。比较珍贵的材料，接种几天后发现污染。若为细菌污染，则舍去，若为真菌污染，可用2%NaClO消毒15min，无菌水漂洗后接种；也可用镊子夹住材料在酒精灯火焰上烧污染部分几秒钟。再换培养基，可减少材料污染损失

④人为污染的防止 在实际操作中，工作人员的责任心、操作技术及熟练程度是减少污染的又一重要环节。

a.责任心：工厂化生产中一定要经常提醒工人认真负责。否则把未灭过菌的碟子当作灭过菌的使用，定会全部污染，培养基排气不彻底或计时时间不够均会引起芽孢杆菌污染。

b.种源选择：由技术熟练、认真仔细的工人负责选苗。选出那些无任何污染迹象的正常种源，并用75%酒精擦拭瓶子外壁、瓶底和瓶盖，尤其是瓶盖和瓶子接缝部位一定要认真擦净。

c.进接种室前用0.01%新洁尔灭洗手,接种前用75%的酒精擦洗双手，穿工作服，戴工作帽、口罩，严禁谈话。

d.接种用镊子、剪刀等工具每用一次都必须严格灼烧灭菌，防交叉感染；接种时瓶子要倾斜,使瓶口位于火焰上方充分灼烧灭菌瓶口,防止打开瓶口时因压力增加而使空气中细菌孢子落入瓶中。接种镊子与切分碟子成45度角,镊子任何时候均不能离开工作区域。手不能伸到碟子上方，防细菌孢子掉入碟中。e.培养过程中,培养室要求清洁，干燥，定期检查，发现污染及时清除。 ⑤引进无菌分化芽污染的防止 因途中运输，瓶外壁会积落灰尘和细菌孢子，先用75%酒精擦洗瓶子并用透明胶布封瓶口，用新纸箱包装。材料运到后及时用75%酒精擦洗瓶子,培养观察一周后转接。对珍贵材料，可每瓶只接一芽,能较好防止污染;对已污染的生根苗，可及时洗出移到珍珠岩或椰糠、河沙等基质中，可减少损失提高出苗率。

第二章 基本原理

1植物细胞全能性

1.1植物的再生现象1.2植物细胞全能性概念

1.2.1细胞全能性的认识过程

Schleiden1838;Schwann1839细胞学说：细胞是在生理上、发育上具有潜在全能性的功能单位。

Harberlandt:1902,高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞。

White 1943，在烟草愈伤组织培养中偶然发现形成了一个芽提出：①.植物的每个细胞都具有该植物体全部的遗传信息。②.每个植物细胞都具有发育成完整植株的能力。 19xx年，Steward等和Reinert等分别从胡萝卜培养细胞中获得了人工胚，首次证实了White所提出的细胞全能性假说

分子生物学：全能性意味着每一个细胞中包含着产生一个完整有机体的全部基因，在适当的条件下，一个细胞就会形成一个完全新的有机体（Sinnoit, 1960；曹宗巽等，1980）。

郑光植等(1980; 1981)认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们“母体”植物的那种合成药用成分的能力―培养细胞的药物生物合成的全能性

19xx年，国际组织培养协会：细胞全能性是细胞的某种特征，有这种能力的细胞保留形成有机体所有细胞类型的能力 林顺全：每个植物活细胞都具有该物种的生命特征属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。

细胞是新陈代谢生理生化活动的场所，也是遗传基因存在的地方，因此具有植物体全部的遗传信息；组成植物体的每个细胞都是由最初的一个细胞分裂产生的，但处在植物体中不同部位的生活细胞受到植株整体的控制和影响，因而总有一些基因受到控制阻遏而不能表答，故完整植株中不同部位的生活细胞通常只表现出一定的形态和生理功能.但当植物的器官组织与植株 5

分离后，就不再受完整植株的控制。如果供给离体细胞组织以合适的营养和生长调节物质。满足离体细胞组织生长发育的条件便有可能促使细胞按其遗传信息的指示分裂、分化、形成组织器官乃至完整植株。

细胞全能性学说认为，植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜能。组培实践表明，虽然不是植物所有细胞都具有全能性，但是的确许多类型的细胞可以在离体培养条件下发育为胚状体或者植株 一般说来高度分化或特化的细胞，如筛管和根冠细胞，已失去分裂和再分化能力，即使在离体培养条件下，也不可能发育成植株。只有那些胚性细胞或分化程度不高的细胞才可具备发育为胚胎或植株的全能性

一个细胞通过脱分化向分生状态回复可能达到的程度，取决于它已有的分化程度。分化程度较低的细胞，如形成层细胞和薄壁细胞，可以脱分化形成营养生长点，再分化产生器官或植株。而分化程度很高的细胞，如厚壁细胞或纤维细胞只能回复到形成层细胞状态，能够分裂形成某些组织，但不可能再生植株。由此看来，被子植物的茎端分生细胞，形成层分生细胞和薄壁细胞属于胚胎干细胞，而其他分化程度高的细胞可以看做是组织干细胞。

分化细胞脱分化条件：创伤和外源激素。创伤使组织中的生长素分布发生变化，伤口处生长素浓度的提高是细胞开始脱分化的直接原因。组培时，培养基中添加的外源激素对细胞脱分化起着决定性的作用

在自然条件下分化细胞通常停止细胞分裂，执行特定的代谢功能，直至死亡。在离体培养条件下，静止的分化细胞脱分化的前提就是启动第一次细胞分裂，分化细胞一旦开始分裂，就可以连续分裂形成分生状态的细胞群体。如果能够揭露启动脱分化第一次细胞分裂时基因表达的细节，找出细胞脱分化的相关基因，我们就能了解细胞脱分化过程的本质，从而达到精确控制细胞全能性表达的目的。

1.2.5植物细胞全能性的实现途径

1.2.5.1离体培养技术在细胞全能性实现和利用中的作用

细胞全能性是通过生命周期、细胞周期和组织培养周期来实现。

2植物细胞的分化

2.1定义 细胞分化：由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。细胞分化的结果，导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能

2.2分子遗传学观点如何解释细胞分化 由受精卵发育成的植物个体，它的每一个细胞在遗传上均是相同的，具有相同的基因组成。植物个体发育的过程，表现为染色体上不同基因，按一定顺序,选择性活化或阻遏。由于不同基因活化的结果，表现为合成不同的酶和蛋白质分子。那么，当同一种基因型的细胞合成不同酶和蛋白质时，即出现细胞分化

3离体培养条件下植物细胞的脱分化和再分化

3.1定义3.2离体培养条件下细胞的脱分化和再分化的时期

愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和来源最为重要。

从接种外植体到形成愈伤组织，大致要经历诱导期，分裂期和分化期等三个时期。这三个时期中细胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。3.2.1诱导期：细胞分裂的准备期即细胞准备进行分裂的时期，通常接种的外植体细胞均是成熟细胞，处于静止状态，欲使其代谢活性加强，迅速进行核酸和蛋白质合成，就必须利用激素和其它一些刺激手段来对其进行诱导

3.2.2分裂期：细胞通过分裂不断增殖的过程，是细胞脱分化的开始.

分裂期细胞的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明

外植体脱分化难易与其种类和生理状况有关，一般幼嫩组织脱分化易，成熟老组织难，花器官脱分化易，茎叶较难，茄科、十字花科脱分化易，禾谷类难.

3.2.3分化期：即通过分裂期的细胞发生生理代谢变化而形成形态和功能各异的细胞并形成愈伤组织的过程.

分化期的特征：细胞形态大小保持相对稳定，体积不再减小，愈伤组织不再增殖。生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有时也呈浅绿色或绿色；老化的愈伤组织则多转变为黄色或褐色。

3.2.4愈伤组织的增殖

愈伤组织形成后，可以分切转接到新鲜培养基上进行增殖，其生长是发生在不与琼脂接触的表面。愈伤组织通常有松脆和坚实两种明显不同的质地，通过调节二者可以互相转变，加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变松脆，减少或除去生长物质，则松脆愈伤组织可以变坚实， 一般地前者更有利于以后的形态发生。

3.2.5愈伤组织状态的调控

来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。颜色可能或是黄或白，外观是光滑或是粗糙，结构可能致密或是松脆，它们的遗传生理功能可能具有胚性，或不具胚性。但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的２-３个特性： ①高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。 ②容易散碎，以便用这此愈伤组织建立优良的悬浮系．并且在需要时能分离出全能性原生质体 ③旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 ④经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作

生长素是促使细胞进入亢进状态（细胞分裂）的因子．细胞分裂素是促使细胞进入保守状态（器官分化）的因子；氮源除供给培养物氮素营养外．还原态氮还具有促进细胞分裂作用．硝态氮具有抑制细胞分裂作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂效果不明显时，增加氨态氮（谷氨酰胺、Arg、水解酪蛋自等还原氮）可起到明显促进分裂作用，使用细胞分裂素或降低生长素对细胞分裂抑制效果不显著时，增加硝态氮或减少还原氮，起到显著的抑制分裂作用。

3.3细胞分化 无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化的研究重点是维管组织的分化，特别是木质部成分的分化，由于技术上的困难．对韧皮部分化过程的研究较少

3.3.1影响维管组织分化过程的因子 生长素和蔗糖是对维管组织分化过程有显著影响的两种物质

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3.4细胞脱分化和再分化的条件

3.4.1植物细胞的机械隔离和生理隔离 整体植物的每个细胞、组织和器官均受其周围的细胞、相邻的组织、器官的制约。一般情况下，它们只能执行着自已特定的功能。

3.4.2植物激素的作用

4影响植物细胞脱分化和再分化的因子

分外因和内因两方面。所谓外因即指植物细胞的营养条件和环境条件；内因即指植物的遗传性和生理状态

4.1培养基组成的影响

4.1.1培养基的营养组成 培养基作用：向细胞提供所需各种营养，调节渗透压、酸碱度和供给水分。

木本植物茎尖培养时如在诱导芽之后反复使用MS培养基，可引起芽退化。

A.硝酸盐和铵盐的比例B.天然复合物类 C.生长素D.赤霉素E.乙烯F.脱落酸4.1.2培养基的渗透压

4.1.3培养基的酸碱度 pH值调节的依据

①按照植物长期生活所适应环境的酸碱度来调节pH值。多数植物为5.8-6.0 ②依据培养基硬度来决定

随pH值升高，培养基硬度也偏硬； ③依据培养基中某些物质的稳定性

4.2环境条件与植物细胞脱分化和再分化

4.2.1温度控制原则依据植物起源和生态类型来决定。喜温性植物：26～28℃。冷凉性植物：18～22℃或＜25℃

4.2.2光质（光的波长）的影响 离体培养条件下，用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为419～467 nm。芽分化有效光谱成分为蓝紫光，波长为419～540 nm，其中蓝光更为适宜，波长为450～540 nm。波长为660 nm的红光，对芽分化无效。根分化则和芽分化相反，根分化受红光600～680 nm所刺激，蓝光无效红光和远红光交替照射对芽器官分化起积极作用

4.3供体遗传性和生理状态与植物细胞脱分化和再分化

4.3.1供体植物的遗传性与器官发生不同基因型，形态建成能力差异很大. 种与种间、品种之间、纯种和杂种间

4.3.1.1种间形态建成能力的差异4.3.1.2品种之间形态建成的差异

柑橘类中，甜橙的离体胚胎发生能力强,宽皮橘（或橘）次之，柚类则比较难。

4.3.1.3纯种和杂种之间形态建成的差异 基因型间形态发生能力差异的原因： (1)由于基因型不同，使其在发育成整体植物的可能性上具有差异。杂合性强的种遗传性不稳定，是导致其形态发生能力比纯种容易的原因。

(2）由于基因型不同，导致生理类型不同。植物体内内源激素的种类、含量（水平）亦不同。因而形态发生能力就不同。

4.3.2供体植物生理状态与器官发生 同一植株上的器官具有不同的生理年龄，同种器官上的不同部位也具有不同的生理年龄。沿植物的主轴，越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，其生理年龄也越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。反之其生理年龄越小

4.3.3植株的发育年龄 植物个体发育经历幼态期、成熟期和衰老期。幼态组织比老态组织具有较高的形态发生能力，特别是生根能力。某些植物成花器官越往植株下部，越易形成营养芽； 无菌苗的年龄也影响外植体苗的再生能力，小白菜萌发3~4d的苗子叶或下胚轴形成的不定芽和苗，再生能力大于苗龄较长的无菌苗。

极性现象，芽、苗形成的位置有时取决于外植体接触培养基的位置。当外植体以形态学基部放在培养基上，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。

4.3.4培养时间和细胞倍性 愈伤组织培养时间过长或继代次数太多，往往会推迟或降低形态发生的能力，所以一般均取处于旺盛生长期的愈伤组织材料来诱导器官的形成。

5.植物胚状体

5.1定义在植物组织培养中，培养细胞有时可以分化出具有胚芽、胚根、胚轴等类似于胚的结构，这种由愈伤组织不经有性过程而直接诱导产生的类似胚的结构，称胚状体

5.2植物胚状体发生的普遍性 ①花药或花粉培养 可直接或间接得到由小孢子发育而来的胚状体。 ②愈伤组织培养 由器官和组织形成愈伤组织然后诱导胚状体的再发生。是一种间接发生方式， ③离体器官培养 培养离体的各种器官，从器官上直接发生胚状体。 ④单细胞悬浮培养 由悬浮培养的单细胞，诱导胚状体的发生。

5.3植物离体培养中器官发生的基本形式

①先形成根而后在根上形成芽。 ②先形成芽而后在芽基部形成根。 ③在愈伤组织上独立地产生芽和根，然后连接成统一的轴状结构。 ④细胞脱分化后形成类胚结构，然后经历与合子胚相似的发育方式进一步发育成完整植物体

5.4胚状体的类别和特点

5.4.1胚状体的类别 按其来源分：

①体细胞胚。来源于根、茎、叶及其组织和细胞，经离体培养而形成的类胚结构,染色体组为两套，可发育成正常的植物体。 ②生殖细胞胚。来源于大孢子和小孢子细胞,经离体培养而形成的类胚结构。染色体为单套，可发育成单倍性植株。

③三倍体胚。来源于胚乳细胞的胚状体，具有三套染色体组。

5.4.2胚状体的特点

①两极性。胚状体在其发育的最早阶段就具有根端（胚根）和茎端（胚芽）。

②胚状体与培养的供体外植体的维管组织无直接联系。

第三章 植物器官和组织培养

植物器官培养：对植物某一器官的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术。

植物组织培养是狭义组织培养，即指对植物组织（分生组织、薄壁组织等）及愈伤组织进行离体培养的技术

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1.植物器官和组织培养的基本程序

包括：无性繁殖体系的建立、初代培养、继代培养、生根培养及炼苗移栽。

1.1 无菌外植体的获得1.2初代培养物的建立

外植体经过灭菌处理后，要建立起初代无菌培养材料，并使其增殖和发育，需注意：a 无菌环境 b 规范操作 c 条件合适

1.3形态发生和植株再生

无菌培养物在适宜环境中生长发育,形成完整小植株.途径:器官发生和体细胞胚胎发生。

1.4培养产物的观察记载

1.4.1愈伤组织 愈伤组织诱导率：愈伤组织生长量＝培养一定时间后愈伤组织干重或鲜重－接种时愈伤组织干重或鲜重

愈伤组织增重倍数：

1.4.2胚状体 胚状体诱导率：

1.4.3芽 外植体被诱导成芽的方式有两种：一是由顶芽或腋芽萌发产生的丛生芽；另一种是经或不经愈伤组织产生不定芽。

污染率： 芽分化率： 增殖率：

1.4.4根 生根率： 平均根数： 平均根长度：

2植物营养器官培养

2.1植物根段培养 是指以植物的根切段为外植体进行离体培养的技术。是研究根系生理代谢、器官分化及形态建成、药物生产的良好实验体系。

2.2植物茎段培养 对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（含块茎、球茎、鳞茎）进行离体培养的技术。目的是离体快繁，其次是研究茎细胞的分裂潜力和全能性以及诱导细胞变异和突变体的获得等。可获：①单苗（芽）；②丛生苗，③完整植物；④愈伤组织。茎段能否进行芽增殖也受到多种因素的影响，但主要影响因素是生长素和细胞分裂素的比值。

2.3植物叶培养 以植物的叶器官为外植体进行离体培养的技术。包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、叶肉、子叶。研究叶形态发生过程以及进行光合作用、叶绿素形成、遗传转化等。 培养结果：①不定芽或胚状体；②愈伤组织；③成熟叶（由叶原基发育成） 植物“条件化效应”现象，即从离体培养的植物上取得的外植体己具有了被促进的形态发生能力。如厚叶莲花掌的叶外植体在培养中不能产生再生植株，而花茎切段则可再生小植株，用这种再生植株的叶片作外植体时，75％的叶片可以形成再生植株。

3.植物繁殖器官培养

3.1植物花器官培养 对植物的整朵花或花的组成部分（包括花托、花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等）进行培养。

结果：①成熟果实；②不定芽或丛生芽；③愈伤组织

3.2植物幼果培养 指对植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养。结果：①成熟果实；②愈伤组织。

3.3植物种子培养 对受精后发育不全的未成熟种子和发育完全的成熟种子进行离体培养。

结果：①小植株；②愈伤组织；③丛生芽或不定芽。

4.植物组织培养 茎尖培养可能出现：①生长太慢，即茎尖不见明显增大，但颜色逐渐转绿，最后形成绿色小点。原因可能是茎尖进入休眠状态，或生长素浓度偏低，或培养温度低所致。②生长过旺，即接种后茎尖明显增大，随即在其基部产生愈伤组织，茎尖难于伸长，色泽较淡。生长素浓度偏高，或使用了2,4-D，或光照太弱、温度过高。③生长正常，即茎尖色泽逐渐转绿，基部逐渐膨大，有时形成少量愈伤组织，茎尖也逐渐伸长，最终形成小枝

第四章 植物离体繁殖

利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。

与传统营养繁殖相比，特点：①繁殖效率高。 ②占用空间小。③培养条件可控性强。④管理方便，利于自动化控制。 ⑤便于种质保存和交换。

1.植物快繁的器官形成方式 分为:即短枝发生型、丛生芽发生型、器官发生型、胚状体发生型和原球茎发生型。

1.1短枝发生型(无菌短枝型) 指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。与扦插繁殖类似，又称微型扦插。能一次成苗，遗传性状稳定，移栽成活率高。

1.2丛生芽发生型（丛生芽增殖型） 使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法

1.3胚状体发生型 外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。

1.4器官发生型 外植体经脱分化形成愈伤组织，再分化产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养中，经培养获得完整植株的繁殖方法。有时将从愈伤组织途径再生不定芽的方式称为器官发生型，而将外植体直接再生不定芽的方式称为器官型。

1.5原球茎发生型 茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎的繁殖类型。原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官，可以增殖，形成原球茎丛。由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。

2.植物快繁的程序

分无菌材料的获得、初代培养、增殖培养、生根培养、小植株的移栽驯化。

2.1无菌培养的建立2.1.1母株和外植体的选取 用来进行繁殖的材料，应选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株。

2.1.2无菌培养物的获得 选取的各种外植体材料经适当、有效的灭菌处理后，接种在基本培养基中，以检测每个材料的菌类污染情况。一般每一培养瓶中接种一块材料，避免相互污染。对接种15ｄ以上仍未见污染并且成活的外植体，可转移至促使其启 8

动生长的培养基中。

2.1.3外植体的启动生长①腋芽被刺激后进行生长；②茎段、叶片、花芽、子叶和其他器官外植体的伤口处产生不定芽； ③外植体切口表面产生愈伤组织。通常，阶段I的完成需要4~6周，获得的培养产物转移到阶段II中进行增殖。然而，有些外植体可能需要在阶段I中停留较长时间，这时必须将外植体转移到新培养基上。部分木本植物的阶段I完成需1年时间，继代后具有正常茎芽的培养物才能稳定增殖，否则在发育中被抑制，无法增殖。

2.2阶段II—繁殖体增殖 任务是对阶段I获得的培养材料进行增殖，不断分化产生新的丛生苗、不定芽及胚状体。

2.2.1培养材料的增殖 增殖方式既取决于培养目的，也取决于材料自身的可能性。多数植物采用无菌短枝或腋芽萌发或诱导不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式进行增殖；增殖后形成的丛生苗或单芽苗分割后，转移到新培养基中继代培养。每4~8周继代一次 一个芽苗增殖产生小苗的数量一般为5~25个或更多，可进行多次继代增殖，满足生产或其他需求。有时，芽苗随培养时间的延长而出现衰退，即不能生长、茎尖褐化、进入休眠甚至失去再生的潜能，降低培养基中生长调节剂的浓度和避免基部愈伤组织的产生等都可以降低芽苗的衰退。

2.2.2增殖培养基 增殖率是快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量的有效繁殖体。增殖培养基的确定因植物种类、品种和培养类型的不同而异。 最佳浓度应通过实验确定。

2.2.3增殖体的大小和切割方法 增殖茎段应具有最小组织量，即携带一个茎节，但从初代培养物中切割的茎段一般都有2~4个茎节。茎段可以垂直插入培养基中，但插入深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽的萌动。

2.2.4影响增殖的因素以及解决措施 有的能很好继代，有些则不易，即分生再生能力衰退，原因是：

①生理原因，培养过程中逐渐消耗了母体中原有与器官形成有关的特殊物质。②遗传因素，培养中常出现染色体紊乱

③材料的影响 不同种类植物，同种植物不同品种，同一植物不同器官、不同部位，继代繁殖能力不同。一般草本大于木本，被子植物大于裸子植物，年幼材料大于老年材料，刚分离组织大于已继代植物，胚大于营养体，芽大于胚状体大于愈伤组织。

④培养基及培养条件 改变培养基和培养条件来保持继代培养。⑤继代培养时间长短⑥季节的影响

2.2.5提高繁殖速度的方法 通过改进培养基、 改善培养条件达到提高增殖率，缩短增殖周期的目的

2.3阶段III—芽苗生根 阶段II增殖的芽苗有时没根，需将单个芽苗转移到生根培养基或适宜环境中诱导生根。因此，这个阶段的任务是为移栽准备小植株，即将试管人工异养环境中的芽苗转变成在温室和田间能自养生存的植株。芽苗的生根可在离体环境中进行，也可在活体条件下产生。

2.3.1离体生根 也称试管内生根。根的发生都来自不定根，根的形成从形态上分为形成根原基以及根原基的伸长和生长两个阶段。根原基形成包括第1、2次细胞横分裂和第三次细胞纵分裂。细胞横分裂可被生长素促进，根原基启动和形成约历时48h，细胞快速生长约需24~48h，根原基形成与生长素有关，伸长和生长则可在无外源生长素下实现。从诱导到形成不定根，从3~4d到3~4周不等。 基本培养基组成同阶段I，但需降低无机盐浓度，一般用1/2或1/4的量，并减少或除去细胞分裂素，增加生长素的浓度。

壮苗：在阶段II和阶段III之间，将增殖的芽苗转移至无或低浓度细胞分裂素的培养基中培养2 ~ 4周，或添（增）加赤霉素，降低细胞分裂素的作用，这种芽苗在阶段III时，可直接转入无细胞分裂素和赤霉素的培养基中诱导生根。

+2＋影响生根因素：①材料 木本难于草本。②基本培养基 低浓度MS＋Fe盐，NH4多不利生根，Ca有利于根形成和生长。

③激素 愈伤组织分化根多用NAA0.2~6以1~2mg/l居多，胚轴、茎段、花梗生根多用IBA0.2~10,以1mg/l居多。

④其他物质 苹果生根加间苯三酚促进。⑤使用激素方法 生根材料在激素中浸泡或培养一段时间，转入无激素培养基中。 ⑥继代培养 ⑦光照 ⑧pH ⑨温度

2.3.2活体生根 又称试管外生根，芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养5~10d,然后在温室中栽入培养基质（如珍珠岩：蛙石＝2：1)中，并辅以高湿度环境，即经常喷雾，几天后芽苗可自行生根。

还应进行芽苗的选择，淘汰明显不正常、畸形、有病芽苗。

2.4阶段IV一小植株的移栽驯化 是试管苗从异养到自养的转变，有一个逐渐适应过程。移栽前需对试管植株进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打开瓶口，降低湿度，使其逐渐适应外界环境

2.4.1移栽 移栽时先洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。然后将小植株栽入人工配制的混合培养基质中，基质用保湿又透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙、泥炭等按比例混合，以利小植株生长。几天后小植株可形成新的功能根系。移栽小植株还应注意光、温控制。移栽初期光照强度应较弱，经过一段时间适应后，增加光照强度（漫射），适宜温度与植物种类有关，喜温植物25℃左右，喜凉植物18~20℃。温度过高导致蒸腾作用加强，水分失衡，微生物滋生等；温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存活。如使基质温度高于空气温度2~3℃，则有利于生根和促进根系发育，提高存活率。驯化管理阶段，防止菌类滋生，适当喷一定浓度的杀菌剂可有效保护移栽小植株的正常生长。

2.4.2驯化管理 采用加覆塑料薄膜、经常喷雾的方法,提高小植株周围的空气湿度，减少叶面蒸腾。同时逐渐降低空气相对湿度，使其适应自然环境条件

2.4.3试管苗移栽后易于死亡的原因

试管苗在高湿、弱光、恒温下异养培养,出瓶后若不保湿极易失水而萎蔫死亡。

2.4.3.1 形态解剖 （1）根 无根、根与输导系统不相通、根无根毛或极少。

（2）叶 在高湿、弱光和异养条件下分化和生长的叶，叶表保护组织如角质层、蜡质层不发达或无，叶无表皮毛或极少，或存在球形有柄毛和多细胞沾液毛，保湿反光性均差，易失水萎蔫；同时叶片解剖结构上栅栏组织薄或不明显，叶组织间隙大，气孔开口大，存在排水孔，易失水，加之茎的输导系统发育不完善，供水不足，易造成萎蔫死亡。

2.4.3.2生理功能方面 根无吸收功能或极低；叶片无保护组织，加之细胞间隙大，气孔开张大，移于低湿环境下失水极快； 9

同时试管苗生长在含糖培养基中，小苗吸收后，无机磷大幅度下降，减少了无机磷的循环，使RuBP羧化酶呈不活化状态，无力固定CO2或极少固定，光合能力极低 。

2.4.4提高试管苗移栽成活率的技术和措施

2.4.4.1 培育瓶生壮苗 凡生活力强，小苗健壮，有较发达根系的易于移栽和成活；反之，倍性混乱和单倍体小苗、生长不良小苗、弱苗、老化苗、发黄苗及玻璃化苗则不易于移栽或移栽成活率极低2.4.4.2促进试管苗根系的发生及功能的恢复

2.4.5移栽技术

2.4.5.1 培养土要求疏松透气、肥沃、富含有机质、无病虫害,并有一定粘性

2.4.5.2 基质 选用腐熟人畜粪、炉渣、草炭、稻壳、森林腐叶土或直接铲起苗床带杂草表土7~10cm加稻草烧成的火烧土和

3塘泥、园土配合而成。塘泥或园土3份+腐叶土或火烧土1份,每m培养土加100kg腐熟畜粪,1~2kg过磷酸钙和1kg呋喃丹,100g

多菌灵，密闭熏蒸3~5天即可装营养袋或营养钵，先装2/3营养土，再装1/3河沙，试管苗种在河沙中，种完后在营养钵面上撒少量河沙，以覆盖裸露根系。

2.4.5.3 移栽 营养土在移栽前2天淋透水，保证移栽时的土壤湿度60%左右，种完后立即淋定根水,同时向空中喷雾以增加空气湿度2.4.6 使用杀菌剂和抗蒸腾剂

3.植物快繁的商业化应用

目前能进行商业化生产的植物种类仍十分有限，大多数试管苗还停留在实验阶段，其原因为：

①生产成本高；②缺乏生产经验；③市场制约；④试管苗生产性能不稳定。

3.1商业化生产规模及工艺流程3.2商业化生产及效益分析3.2.1试管苗增殖率的估算

增殖率多数以芽或苗为单位，或以瓶为单位。增殖率的理论值是指接种一个芽或一块增殖培养物，经过一段时间培

养后得到的芽或苗数。

出现差异的原因是：①污染淘汰；②出售、转让和实验所用；③移栽死亡；④培养容器等设备的限制。

3.2.2提高繁殖速度方法 改进培养基 改善培养条件

3.2.3生产计划的制定和实施3.2.4产品质量监控3.2.5商业化生产效益分析 3.3降低商业化生产成本的措施

A.提高劳动生产率B.减少设备投资，延长使用寿命 C.降低消耗 D.降低污染，提高繁殖率和成活率 E.简化培养基 4商业化生产应注意的问题

4.1污染

4.2遗传稳定性A影响遗传稳定性的因素 ①基因型 ②继代次数 ③器官发生方式

B降低遗传变异的措施 ①选用不易发生遗传变异的基因型材料；②缩短继代时间，③采用不易发生遗传变异的增殖途径； ④采用适当的生长调节物质和较低浓度，及时剔除生理和形态异常苗。

4.3玻璃化 植物组织培养中，可以观察到分化形成一些半透明状的畸形试管植物，称为“玻璃苗”，在离体培养中，再生植株成长为“玻璃苗”的现象称为“玻璃化现象(vitrification)

A.形态解剖学特点 植株矮小肿胀，叶片、嫩梢呈半透明状;茎短而粗，几乎无节间；叶片厚而狭长,皱缩或卷曲，脆弱易破碎；叶表无角质层，无功能性气孔器，叶仅有海绵组织,没有栅栏组织

B.生理生化变化 玻璃苗的干物重、叶绿素含量、蛋白质含量下降，纤维素和木质素含量低，角质层、栅栏组织发育不全,且生根性能极差.与木质素合成有关的羟基肉桂酸,COA连接酶和与木质化进程有关的苯丙氨酸氨解酶的活性比正常苗低得多。碱性过氧化物酶同工酶活性上升，而酸性过氧化物酶同工酶活性下降。可溶性酚含量发生明显变化。

C.玻璃化苗发生原因①材料 培养材料种类和外植体类型及大小显著影响着玻璃苗的发生 ②培养基的琼脂和蔗糖浓度。与试管苗玻璃化程度呈负相关 ③培养温度光照。与玻璃化程度呈正相关 ④培养基成分 ⑤生长调节剂浓度 高浓度的细胞分裂素可促进芽分化，也使玻璃化发生比例提高 ⑥培养瓶中乙烯浓度

D.玻璃化苗发生机理 试管苗在胁迫培养环境中，如水势不当、通气不畅、生长调节剂浓度过高、温度过高等，导致乙烯产生。过剩的乙烯抑制了试管苗体内乙烯的生物合成，诱发了其他激素质和量的改变及酶类变化，如降低苯丙氨酸解氨酶和酸性过氧化物酶的活性，从而发生蛋白质、纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解黄化，壁压降低，细胞过分吸水，导致玻璃化苗形成

E.防止玻璃化苗发生的措施①选不易玻璃化的基因型及部位做外植体提高培养基硬度，降低培养基水势；②提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂③利用可透气性瓶塞材料，增加琼脂浓度，降低培养瓶中过饱和湿度，增加气体交换；降低培养基中的水势。

+④降低培养基中NH4的浓度，并及时转移⑤增加光照强度，适当降低培养温度⑥一些添加物或抗生素可减少或防止玻璃化发生，

如马铃薯汁、活性炭可降低油菜玻璃化苗频率，CCC、PP333可减少重瓣丝石竹玻璃化的发生，聚乙烯醇可防止苹果砧木玻璃化，青霉素G钾可防止菊花玻璃化，青霉素可降低芥菜玻璃化。添加植物激素合成前体如ACC等

⑦选择适宜的糖源及外源激素的种类和浓度。并注意生长素与分裂素的配合。

4.4褐化 很多植物尤其是木本植物含有较多的酚类化合物。在完整植物的细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在比较稳定。当切割外植体后，切口附近细胞分隔效应被打破，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶便氧化酚类化合物成为褐色的醌类物质和水。使培养基变黑并严重抑制外植体生长和分化的现象。

A.影响褐变的因素 ①基因型 木本植物一般比草本植物容易发生褐变，因为木本植物的单宁或色素含量较高，而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，所以木本植物易褐变。②外植体年龄、大小和取材时间。

③外植体损伤。④光照 ⑤温度。⑥培养时间过长。 ⑦培养基成分

B.防止外植体褐变的措施。 ①.选择适当的外植体 ②适宜的温度和暗培养 ③将外殖体不断转移到新培养基上，以防止多酚氧 10

化酶的大量积累④加入一些氧化剂或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可大大减轻醌类物质的毒害。Vit.C，PVP，半胱氨酸。⑤0.1%-0.5%活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明显 ⑥选择适宜的培养基，调整激素用量

4.5黄化 黄化是指试管苗幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳的现象。

A.黄化发生的影响因素 ①培养基成分。铁元素含量不足，矿物质营养不均衡，激素配比不当，糖用量不足或已耗尽。 ②培养条件 ③pH ④抗生素类。培养基中添加一些抗生素类物质

B控制黄化发生的措施 ①检查培养基配制过程，保证培养基成分正确添加；②调节培养基组成和pH;③控制培养室温度，增加光照，使用透气瓶塞改善瓶内通气情况；④减少或不用抗生素物质。

胚胎培养及离体授粉 植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。

1.植物胚培养

1.1胚培养的类型 成熟胚培养：实质上是胚的离体萌发生长，发育过程同正常种子萌发。成熟胚生长不依赖胚乳贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，就可在简单培养基上萌发生长，形成幼苗。幼胚培养：指未发育成熟的胚培养，要求较好的培养条件和较复杂的操作技术（胚剥离）。

早熟萌发：幼胚接种后，离体胚不继续其胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗的现象称早熟萌发。

胚乳培养的应用 获得三倍体幼苗和植株。

离体授粉是指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，又称离体受精或试管受精。根据无菌花粉授于离体雌蕊的位置，可将离体授粉分为三种方式，即离体柱头授粉、离体子房授粉和离体胚珠授粉。

第五章 无病毒苗木培育

1. 病毒病害概述1.1病毒的危害1.2植物病毒病害的病原 包括：病毒、类病毒、植原体、螺原体和难培养细菌。

1.4植物病毒分布和为害

1.4.1植物病毒的地理分布

1.4.2病毒在植物体内的分布 植物病毒具有系统侵染特点，在植物体中除生长点外各个部位均可带毒，但不同器官、组织部位带毒量差别较大，即病毒在寄主体内呈不均匀分布 。

1.4.3病毒对植物的为害①植物病毒的种类②植物病毒病的主要症状 分内部症状和外部症状。内部症状指植物组织和细胞的病变，如组织和细胞的增生、肥大，细胞和筛管坏死及各种类型内含体等的出现。外部症状指在一定环境下，由于植物本身的正常生理代谢受到干扰，叶绿素、花青素及激素等改变，从而使植株表现出异常状态，如植株矮小，叶片失绿或变色，果、叶畸形等。 ③植物感染病毒后对生长和经济性状的影响

2.植物病毒的传播 根据自然传染方式分为介体传播和非介体传染两大类。介体传播：病毒依附在其他生物体上，借其他生物体的活动而进行传播。植物种子带毒及无性繁殖材料带毒，它们只是从母体接受了病毒，使自己发病，它所带的病毒还须借助于其他传染方式才能达到其他植株或植物上。 非介体传播：植物病毒从寄主体上，由于伤残或分泌而达到体外，与另一寄主通过微伤接触而传染，或通过寄主细胞间的有机结合而传染。非介体传播分为：病毒越出本寄主体外传染的，有液汁擦伤、嫁接、花粉和“土壤”传染等；通过繁殖器官进行传播的有种子及无性繁殖材料。

2.1介体传播 病毒介体包括一切除寄主植物本身器官或部分以外，可以传带传染病毒的生物。昆虫、螨类、线虫、真菌、冤丝子等2.2．非介体传播

①机械传播 也称为汁液摩擦传播 。 ②土壤传播、嫁接传播 ③种子和花粉、无性繁殖材料传播

3植物脱病毒的意义

3.1脱毒的重要性 许多优良的传统品种， 长期栽培，病毒病害日益严重，难以控制。

3.2脱毒的经济意义 植物脱毒可使品种复壮，提高产量、品质。植物经脱毒后，生长势增强，产量和质量显著提高，产量的提高幅度最高可达300％。

4.植物脱病毒的机理

4.1茎尖分生组织培养脱毒 已知病毒是DNA大分子，病毒侵染植物后可进入植物细胞。当植物细胞分裂时，病毒DNA随着复制。植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在植物细胞伸长期间，是病毒核蛋白合成占优势。生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞。分裂速度比病毒DNA复制速度快，采用旺盛分裂的生长锥（顶端分生组织）培养，就可能脱除植物病毒。同时病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。受侵染的植株中，顶端分生组织无毒或含毒量极低。原因可能是：

①传导抑制：植物病毒自身不具有主动转移的能力，病毒可通过维管束组织系统长距离转移，分生组织中不存在维管束。通过胞间连丝在细胞间移动，速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖。②在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制。③植物体内可能存在病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。④激素抑制：在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖。

4.2热处理脱毒：a 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去侵染能力。 b 热处理是一种物理效应，可以加速植物细胞分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。

5.植物脱毒方法

5.1物理方法 热处理可由受侵染的个体得到无毒植株。可通过热水或热空气进行，前者对休眠芽效果较好，后者对活跃生长的茎尖效果较好。但并非所有病毒都对热处理敏感。

5.2化学方法 在组织培养消除病毒的过程中培养条件也能起某些作用。如200μm长的烟草茎尖区域带有CMV，但此外植体却常 11

再生无毒植株，病毒的消除可能是由于培养基中生长调节物质的作用。

5.3生物学方法

5.3.1茎尖分生组织培养脱毒 外植体 顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的部分，最大直径约为100μm，最大长度约为250μm。茎尖是指顶端分生组织及其下方的1-3个幼叶原基。通过顶端分生组织培养消除病毒的几率高，但多数无毒植株是通过培养茎尖（250-1000μm）得到的。

B.操作方法①培养基 ②外植体 茎尖应大到足以根除病毒，小到足以发育成一个完整植株。茎尖越小，茎尖内营养、水分越难长时间维持，成功率越低，对培养基和剥离技术要求越高。 ③培养条件 光照培养常比暗培养好。温度一般为25℃±2℃。 ④外植体的生理状态 茎尖最好取自生长活跃的芽上。培养菊花的顶芽茎尖比培养腋芽尖效果好，但每个枝条上只有一个顶芽，为增加脱毒植株总数，即使腋芽比顶芽表现较差，也可采用腋芽。

D.茎尖培养的生长可能有4种类型

① 组织不增大，不久变褐死亡，可能生长点受伤。② 组织间变绿，但增大缓慢，可能生长素浓度太低，提高温度

③ 组织基部不产生或少量产生愈伤组织，生长点发育正常，1个月内形成无根植株，最佳。④ 茎尖基部产生大量愈伤组织而生长点很少生长，不理想，应促其分化

5.3.2愈伤组织培养脱毒法 并非所有愈伤组织的细胞都带有某种病原菌。受病毒侵染的愈伤组织中的某些细胞不带病毒，可能是病毒的复制速度落后于细胞增殖速度，或有些细胞通过突变获得了抗病毒特性，或抗病毒侵染的细胞可能与敏感型细胞一起存在于母体组织中。

5.3.3微体嫁接离体培养脱毒法 把极小（＜0.2mm）的茎尖接穗嫁接到实生苗砧木上，然后连同砧木一起在培养基上培养。

5.3.4珠心组织培养脱毒法 病毒是通过维管组织移动的，而珠心组织与维管组织没有直接联系，不带或很少带毒，可以通过珠心组织培养获得无毒植株。5.3.5培育抗病毒栽培种 5.3.6抗病毒基因工程

5.4综合脱毒方法

5.4.1茎尖培养结合热处理脱毒法 某些病毒，如TMV、PVX和CMV等能侵染正在生长中的茎尖分生区域，将茎尖培养与热疗法相结合。热处理可在脱毒之前的母株上或在茎尖培养期间进行。热处理时要注意处理材料的保湿和通风，以免过于干燥和腐烂。

5.4.2茎尖培养结合病毒钝化剂处理脱毒 培养基中加入碱性孔雀绿、2，4-D及硫脲嘧啶等病毒抑制剂能显著提高脱毒率。

6. 无病毒植株脱毒程序6.1材料准备

①决定植物种类及品种。选用生长健壮，遗传性一致的品种为材料。 ②了解该植物体内所具有的病毒种类及危害程度。选择指示植物。 ③决定脱除病毒的方法

6.2生长点分离和培养

①从罹病的植株上切取顶芽或腋芽。②材料表面灭菌。 ③根据病毒在寄主内分布位置决定切取茎尖大小。如果热处理，决定热处理的温度、时间。 ④接种成功率与茎形状结构有关。

7.脱病毒植株的检测和保存 经过脱毒处理产生的无毒植株，用作无病毒原原种或原种使用前，须针对特定的病毒进行检测，以确保无毒苗的质量。由于培养物中很多病毒具有延迟复苏特性，常在最初的一两次病毒检测中呈阴性，因此，前18个月需对植株进行多次检验。无毒植株还可重新感染，在繁殖过程中必须进行重复的检验。

7.1脱病毒植株的检测

7.1.1生物学鉴定

7.1.1.1.直接测定法 观察茎叶有无特定病毒引起的可见症状：脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好；带毒株长势弱，叶片表现褪绿条斑、扭曲、植株矮化（大蒜）、花叶或明脉、脉坏死、卷叶、植株束顶、矮缩（马铃薯）、花叶褪绿斑点（甘薯、香石竹）等。症状诊断时要注意区分病毒病症状与植物的生理性障碍、机械损伤、虫害及药害等表现。

7.1.1.2.指示植物法（汁液感染法） 多数植物病毒有一定的寄主范围，通过接种这些病毒可在某些寄主植物上表现特定症状，指示植物是指接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物。接种方法：汁液摩擦接种和嫁接传染。

7.1.2血清学鉴定 病毒由核酸和蛋白质组成，是一种抗原，注入动物体产生一种抗体，抗体存在于血清中，称抗血清，不同病毒产生的抗血清有其特异性，用特异病毒抗血清鉴定该种病毒，具高度专一性和特异性。

7.1.3分子生物学检测7.1.4电镜鉴定法

7.2脱病毒植株的保存

第六章 花药和花粉培养

1. 概念和应用

1.1概念 花药包括二倍性的药壁和药隔组织以及单倍性的雄性性细胞—花粉粒。花药和花粉培养都指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株。只不过后者是将花粉从花药中游离出来，成为分散或游离态进行培养

花药培养：指把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。

与花药培养相比较，花粉培养不存在花药中的有害物质，不影响小孢子启动第一次分裂；排除了药壁、药隔、花丝的干扰，从小孢子中获得的材料是纯合的；小孢子能均匀地接触化学和物理诱变因素，是研究吸收、转化和诱变的理想材料；小孢子培养可观察到雄核发育的全过程，是很好的遗传和发育研究的材料体系；可以从每个花药中获得更多的单倍体。

1.2花药和花粉培养的应用

2.花粉小孢子发育途径 离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为 12

“雄核发育”

2.1活体小孢子发育途径 花粉发育时期对诱导雄核发育是极其重要的。花粉母细胞经减数分裂形成四分体，体细胞组织分泌出胼胝质到四分体表面，花粉四分体的胼胝质壁溶解并释放出四个小孢子。小孢子细胞质浓厚，中央有一细胞核。

当液泡发生时，小孢子体积迅速增加，细胞核被挤向一边（单核靠边期）。在第一次有丝分裂时，小孢子核产生一个营养核和一个生殖核。第二次分裂仅限于生殖核，形成两个精子。

2.2离体小孢子发育途径

2.2.1雄核发育途径

离体培养时，尽管雄核发育可在四分体时期和双核花粉期被诱导，但最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。

小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核发育分为A途径（不均等分裂）和B途径（均等分裂），其中A途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为A-V途径、A-G途径、A-VG途径（又称E途径）及C途径。 a.A途径 小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞：

① A-V途径 多细胞花粉（或多核花粉）由营养细胞重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成仍存在。生殖核并不参与花粉孢子体的形成 。

②A -G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄

③A-VG途径（又称Ｅ途径） 花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞

④C途径 生殖细胞和营养细胞通过核融合后共同形成多细胞花粉，产生非单倍体植株。生殖核与营养核共同参与了花粉植株的形成。b.B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞。以后，由这两个细胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。

2.2.2雄核发育的启动机理 无论雄核发育采用哪种途径，小孢子或雄配子体都是偏离了正常的发育途径,形成了形态不同于正常花粉的胚性花粉粒，表观为：核位于花粉粒的中心，醋酸洋红压片观察，花粉粒着色较浅，有液泡和两个清晰着色的核。是具潜能的胚胎发生花粉，称P-花粉或E-花粉。这类花粉体积小，也称小花粉(S-花粉）.细胞质稀薄，不积累淀粉，染色浅或不着色，称不染色花粉（NS-花粉）

2.3花粉植株形态发生方式

2.3.1胚状体发育途径 小孢子的行为与合子一样，经历了如同活体条件下诱导胚发生的各个阶段

2.3.2愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，从花药壁上冒出来

3.花药和花粉培养方法

3.1花药培养 适宜的气候条件下，从生长健壮的植株上选取一定大小的花蕾。先用醋酸洋红压片镜检，观察花粉的发育时期并确定花蕾大小与花粉发育年龄的相关性，根据所得结果采集一定大小的花蕾。因为未开放花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，用70％的酒精棉球擦洗花的表面即可。 无菌条件下取花药时要特别小心，防止花药损伤，否则刺激花药壁形成愈伤组织，同时这种损伤可能也会使花药产生一些不利于培养的物质。25℃有光或黑暗条件下进行脱分化培养。2~3周后，花药中的小孢子经大量分裂形成胚或愈伤组织，转入分化培养基上培养，4~5周后，小植株形成。

3.2花粉培养 花粉培养:又叫小孢子培养，是从花药中分离出花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而发育成完整植株的过程。

3.2.1花粉分离与纯化①自然散落法②挤压法 ③机械游离④小孢子分离和纯化 3.2.2花粉培养方式①平板培养 ②液体培养③双层培养 固体~液体培养。 ④看护培养 花药或花药的愈伤组织放在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药或愈伤组织上，将花粉置于滤纸上方。⑤微室培养 ⑥条件培养基培养 在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培养基中，接入花粉进行培养

3.3移栽驯化花粉植株非常娇嫩，很难移植。需采取逐步过渡的方式，使其适应从异养到自养。

3.4白化苗现象禾谷类作物的花粉白化苗比例很高（有的可高达80％以上），成为禾谷类单倍体育种实践的很大障碍。和绿苗相比，花粉白化苗除了缺乏绿色外，并无其他明显的形态学变异。 3.4.1.影响白化苗形成的因素① 供体植物基因型 花药培养中花粉白苗率与接种材料的基因型有关。不同的植物种类及同种植物的不同品种之间分化白化苗的频率差异较大。

②花粉发育时期花药培养中，白化苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高，小孢子已完成有丝分裂的花药往往只能得到白化苗。 ③培养基成分④ 培养温度

3.4.2.白化苗的细胞学和生理生化特性 白化现象是不可逆的。如果培养小麦花粉白化苗的叶片，所得到的再生植株全部为白苗，说明白化现象很可能是一种特殊的变异或突变。在白苗及分化白苗的愈伤组织细胞中常见到微核，其往往起源于断裂染色体，因此染色体结构的变异可能是白化苗的成因。

3.5影响雄核发育和花粉花药培养的因素

3.5.1基因型 植物属间、种间、品种间存在差异。水稻粳稻花药愈伤诱导率10％，籼稻1~2％。

3.5.2植株生长条件和生理状态供体植株要在比较适宜条件下生长，定期施肥灌水，取样前3~4周避免使用杀虫剂。大田植株比温室生长植株更适于花药培养，相对幼年植株上开花始期的花对培养的反应较好。

3.5.3花粉发育时期3.5.4预处理

接种前或后对花药采用高低温、化学物质、离心、射线等进行预处理，能使绿苗产量大量增加。

4.单倍体植株鉴定和染色体加倍

4.1花粉和花药植株的倍性鉴定

①染色体直接计数法 ②间接鉴定a扫描细胞光度仪(流式细胞仪)鉴定 b细胞形态学鉴定法 c植株形态学鉴定法 d高/低温胁 13

迫法 e杂交鉴定法 f分子标记鉴定 ①生化标记鉴定。同工酶鉴定。若等位基因纯合时，无论其拷贝有多少，表现在酶谱带上仅有一条酶带，等位基因杂合时，则呈现不同的酶带。②分子标记研究。RFLP（限制性片段长度多肽性）和RAPD（随机扩增多肽性）是常用的DNA分子标记技术，

4.2花粉和花药植株的染色体加倍

4.2.1茎段培养 单倍体愈伤组织培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂及花粉核的融合，形成二倍体细胞，

4.2.2化学试剂诱变 秋水仙素

①秋水仙素诱导a浸泡法。 b生长锥处理。c培养基处理。将单倍体植株的任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的培养基中继续培养。

花药培养的一般程序

①取材 花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片镜检，确定花粉的发育时期，找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好．

②预处理 低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草7-9℃，7-14d；水稻7-10℃，10-15 d；

③消毒 花药适宜培养时，花蕾尚末开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态。

④接种 在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤．若受损伤，则应淘汰，

由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度

⑤培养方式和培养条件 花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加入30％Ficoll的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。

⑥花粉植株的诱导 烟草花药接种在无激素培养基上1周以后．即有部分花粉粒开始膨大,2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，井逐渐长成小苗。 ⑦壮苗和移栽⑧单倍体植株的二倍化

第七章 细胞培养

1 定义 植物细胞培养是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。

细胞培养的意义 ① 建立单细胞无性系，进行细胞生理代谢及各种不同物质对细胞代谢影响的研究；

② 单细胞的克隆，把微生物遗传技术用于高等植物，进行农作物改良； ③细胞培养增殖速度快，适合大规模悬浮培养④ 采用生物化学的方法，对培养的单细胞进行人工诱发突变。⑤ 花药培养中排除体细胞干扰 ⑥ 遗传转化受体的建立

细胞培养的内容① 悬浮培养：促进细胞生长和生物合成② 单细胞培养：促进细胞生长和形成完整植株

4单细胞培养

4.1 单细胞的分离① 由完整的植物器官分离单细胞② 由培养组织中分离单细胞

4.1.1由完整的植物器官分离单细胞

4.1.1.1 机械法 叶组织是分离单细胞的最好材料。

A: 用刀片刮叶片 方法：首先撕去叶表皮，使叶肉细胞暴露，然后用解剖刀把细胞刮下来，直接接种在液体培养基中培养。B:叶片研碎、离心先把叶片组织轻轻研碎，然后再通过过滤和离心将细胞纯化。与酶解法相比，机械法分离的细胞：① 细胞不受酶的伤害；② 不会发生质壁分离。一般用机械法分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织，但只有在薄壁细胞组织排列松散、细胞间接触面很小时，用机械法分离叶肉细胞才能成功。③ 细胞产量低，同时细胞易破。

4.1.1.2 酶解法利用果胶酶处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞

取充分展开的叶片表面消毒，蒸馏水冲洗干净，撕去下表皮，切成4cm ×4cm的小块，放入经过滤灭菌的酶液（含果胶酶0.5%＋甘露醇0.8%＋硫酸葡聚糖钾１％）中，用真空泵抽气，使酶液渗入叶肉组织内。在摇床上保温培养，每30min更换一次酶液，将第1次30min后换出的酶液弃掉，第2次30min后，主要分离出海绵薄壁细胞，第3、4次主要分离出栅栏细胞。加入硫酸葡聚糖钾:作为原生质膜的稳定剂，降低酶液中核糖核酸酶的活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞的产量。用于分离细胞的果胶酶不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。因此，用酶解法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。

4.1.2 由培养组织分离单细胞

① 诱导产生愈伤组织； ② 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性； ③ 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物。

4.2 单细胞培养 单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。

培养方法有平板培养法、看护培养法、微室培养法和条件培养基培养等

4.2.1平板培养：将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分混合，再倒入培养皿中进行培养的方法 先对含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物进行细胞计数，得到细胞密度。然后过滤，除去较大的细胞团，留下游离的单细胞和小细胞团，从而得到单细胞无性系 将含0.6%-1％琼脂的培养基灭菌，冷却到35℃，放到恒温水浴中，将细胞悬浮液接种进去，充分混合后倒入培养皿中。在这个过程中要做到：当培养基凝固之后，细胞能够均匀分布并固定在很薄一层（约1 mm厚）培养基中。然后用封口膜或石蜡把培养皿封严，用40倍倒置显微镜计量细胞数。将培养皿放在25℃下暗培养。

用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化的遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。特点: ① 可以定点观察；② 分离单细胞系比液体浅层培养容易③ 培养细胞气体交换不畅。 14

平板培养必须注意： ①选用的培养基无论是条件培养基还是合成培养基，其目的是能够在低的起始密度下使细胞生长； ②不可选用处在静止期过久的细胞； ③在固体培养基中适宜的起始密度因不同的植物种类而异 ④接种细胞时固体培养基的温度要严格控制。

4.2.2.看护培养：用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。

用途；诱导形成单细胞系。

做法： ① 在一个培养瓶中加入一定量的固体培养基，灭菌后备用。② 在无菌条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm?）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。③ 将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。④ 恒温培养。

要求： ① 看护愈伤组织处于活跃生长状态；② 愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。

离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养下则分裂，为什么？

看护愈伤组织不仅给单细胞提供了培养基的营养成分，而且还提供了促进细胞分裂的其他活性物质。

特点： ① 效果好，易于成功。 ② 简便易行。 ③ 不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。

注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。

4.2.3 微室培养： 将细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的方法。特点是在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。

方法 先由悬浮培养液中取出一滴只含有单细胞的培养液，放在一张无菌载玻片上，在这滴培养液四周与其相隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的“围墙”。在“围墙”左右两侧再各加一滴石蜡油，再在每滴石蜡油上放一张盖玻片作为微室的“支柱”，然后将第三张盖玻片架在两个支柱之间，构成微室的“屋顶”。要求： ① 微室内不能有气泡。② 最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片厚度在0.17~0.18mm。③ 观察时要保持温度和培养时的一致。

4.2.4 条件培养基培养 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。

制作方法：把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。

4.2.5 其它单细胞培养技术

植物细胞在液体中的流动性使之不能固定，同时团聚性和在低密度下难以启动分裂，使真正的单细胞培养十分困难。 ① 饲养层培养：将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对培养细胞起到一个饲养作用，有利于培养细胞的分裂。

② 双层滤纸植板培养: 在培养皿中倒入琼脂培养基，待其凝固后，先将饲养细胞平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张滤纸形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层上，然后将培养细胞置于其中。

单细胞在饲养层上快速生长，而且以后能将克隆细胞团非常方便地转移至新鲜培养基上继续培养

细胞悬浮培养： 悬浮培养是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。

优点：能大量提供比较均匀一致的细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模培养,根据一个培养周期中是否添加培养基，分成批培养、连续培养和半连续培养方式等。

5.1 成批培养（分批培养）

指在一个培养体积中接种细胞和添加培养基后，中途不再添加培养基也不更换培养基的方式。细胞生长动态:S型曲线 在一个培养周期中，当细胞生长进入缓慢生长达到静止期时，往往是细胞次生代谢产物积累的时期，此时应尽可能维持细胞活性，延长生产周期，以便获得较高的产物积累。 为达此目的，在成批培养基础上，发展了饲喂批量培养：当细胞生长快进入缓慢期时，在培养系统中添加一定量的有利于目的产物合成的培养基，以提高目的产物的积累量。

优点 培养装置和操作简单，但在培养过程中细胞生长、产物积累，以及培养基的物理状态常随时间的变化而变化，培养检测十分困难。同时，成批培养的周期较短，一个培养周期后，细胞和培养液同时取出进行目的产物提取，下一个培养周期必须重新接种种子细胞，增加培养成本。

继代方法:用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 最佳继代时期：了解细胞数目增长变化S形曲线后，选择对数生长期和直线生长期！

细胞生长曲线 在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线

细胞生长各个时期的特点：

① 滞后期:细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关 ② 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变 ③ 直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期细胞生长各个时期的特点： ④ 缓慢期:生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少 ⑤ 静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。

半连续培养： 完成成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。

半连续培养 特点 节省种子细胞培养的成本，同时保留的培养液有利于细胞分裂的启动。但多数情况下，由于保留细胞悬液中细胞状态有较大差异，特别是有些衰老细胞不能及时淘汰，会影响下一培养周期细胞生长的一致性。

连续培养： 培养过程中，当接种细胞生长达到一定密度后，不断向反应器中以一定的流量添加新培养基，同时以相同 15

的流量从系统中取出培养液，维持培养系统内在细胞密度、产物浓度以及物理状态上的相对平衡的培养方式。

优点： 可以延长细胞培养周期，从而延长目的产物积累时间，增加目的产物产量。同时，由于系统进入稳定状态后，细胞密度、基质及产物浓度等趋于恒定，因而便于对系统的检测。但装置相对较复杂，对反应器的设计要求较高。

当细胞生长和产物合成需要不同的培养基时，则采用两步法建立培养体系，先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。

封闭型连续培养 在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。

开放型连续培养 注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使培养细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。为了保持在开放型连续培养中细胞增殖的稳定性，可采取：

a.浊度恒定式。在浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断注入的，受细胞密度增长所引起的培养液浑浊度增加的控制。可以选定一种细胞密度，当超过这个细胞密度时，使细胞随着培养液一起排出，以保持细胞密度的恒定。

b化学恒定式。通过限制营养物质的浓度来控制细胞的增长速度。一是以固定速度注入新鲜培养基，将培养基内的某种营养成分的浓度调节成为一种生长限制浓度，从而使细胞的增殖保持稳定状态。二是控制培养液进入的速度，使细胞稀释的速度正好和细胞增殖的速度相同，培养液中细胞密度一直保持恒定状态。

悬浮细胞的继代 细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到最大生产量，就必须进行继代培养。最适周期一般为1~2

５周，继代时间为1周的细胞系可用1:4的接种量，2周的可用1:10的接种量。 起始细胞密度：0.5 ~２.5×10个/ml，

6培养过程中可增殖到1~4×10个/ml。细胞平均分裂4~6次，需18~25d。

培养细胞的同步化 同步培养是指在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期（G1,S, G2和M）的各个阶段，同步程度以同步百分数表示。

同步性程度 衡量① 有丝分裂指数② 某一瞬间处于细胞周期某一特定点上的细胞所占的百分数③ 一个短暂具体的时间内通过细胞周期某一点的细胞的百分数④ 全部细胞通过细胞周期某一点所需的总时间占细胞周期时间的百分数

实现同步化的方法: ①饥饿法 先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间饥饿后，重新加入这种限制因子，静止细胞同时分裂

②抑制法 使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、胸腺嘧啶脱氧核苷等核苷酸类似物阻止DNA合成，抑制剂除去，细胞就进入同步分裂。

6培养细胞蛋白质和DNA含量变化

6.1蛋白质含量 各类材料中胚性愈伤组织的可溶性蛋白质含量远高于非胚性愈伤组织。非胚性细胞系中游离氨基酸高于胚性细胞系6.2DNA含量 DNA合成只限于核大、圆形的胚性细胞和细胞团。DNA复制不仅为细胞增殖奠定了物质基础，也为细胞分化提供了条件。

7 影响细胞培养的因素

7.1培养基7.2 细胞密度 指单位体积内的细胞数目，常以每毫升培养液中含有多少个细胞表示。起始密度是细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。

7.3 植物生长调节剂 7.4 pH和CO2

8单细胞培养的程序 含建立细胞株，高产细胞株选择、分化培养或扩大培养，鉴定和提取等程序

8.1建立细胞株

A 确定材料①选择易于分散的花粉为材料。②选择分散性好的愈伤组织为材料。③从经酶处理的叶肉、根尖、髓组织取材。

B 悬浮细胞液的制备 ① 将分散性好或经酶处理过的组织，置于液体培养基中，80-90r/min振荡培养。

② 用200-300目不锈钢网过滤，除去细胞团和组织块；再以4000r/min离心，除去残渣碎片，获得纯净的细胞悬浮液。

8.2 高产细胞株的选择 ①将得到的细胞群，进行平板培养，使之形成细胞团。

②初步鉴定和测定 根据培养目的选择高抗、高品质、高产，即对某种氨基酸、生物碱、酶类、萜类、甾体类、天然色素类合成能力强的“细胞株”

8. 3 鉴定和提取 ① 对再生植株进行产量、品质及抗性鉴定和遗传分析。② 对生化产物进行提取和测定。

8.4单细胞培养的技术关键① 细胞的起始密度② 培养周期③ 培养基条件

9. 细胞生长和活力的测定

9.1 细胞生长测定①细胞计数 先用铬酸（5％~8％）或果胶酶（0.25％）对细胞和细胞团进行处理，以增加细胞的分散性。

9. 细胞生长和活力的测定

②细胞总体积及细胞密实体积（ PCV） 将已知体积的均匀分散的悬浮液放入１个15ml的刻度离心管中，2000g下离心5min,得到细胞沉积体积，细胞密实体积=每毫升培养液中细胞总体积的毫升数

③细胞鲜重和干重 把悬浮培养物过滤,用水洗去培养基，真空抽滤除去多余水分,称量细胞鲜重. 60℃干燥12h，称量。细胞干

6重以每毫升培养物或每10个细胞的重量表示。

④细胞有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。 孚尔根染色，随机检查500个细胞，统计处于各有丝分裂时期的细胞数，计算分裂指数。

⑤细胞植板率 能分裂长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数，用于平板法培养单细胞或原生质体。

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9.2 培养细胞活力的测定

① 四唑盐还原法（TTC法）活细胞具有脱氢酶，将TTC还原成红色TTF，显微镜下观察。也可TTF用乙酸乙酯提取出来，用分光光度计测定（520nm），计算细胞的相对活力②伊凡蓝染色 用0.025%伊凡蓝溶液处理细胞，只有死细胞和活力受损伤的细胞能够吸收这种染料，完整的活细胞不能摄取或积累这种染料。

③荧光素二乙酸法 将FDA贮备液加入到细胞或原生质体悬浮液中，使最终浓度为0.01％。同时加入渗透压稳定剂保温5min，荧光显微镜检查。FDA既不发荧光也不具有极性，能自由地穿越细胞膜进入细胞内部。在活细胞内FDA被酯酶分解，产生有荧光的极性物质—荧光素。由于荧光素不能自由穿越细胞膜，因而就在活细胞中积累，而死细胞中不能积累。

第八章 植物原生质体培养及细胞融合

原生质体(protoplast)指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。

①亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，称作亚原生质体。具有或无细胞核

②微小原生质体(miniprotoplast)：利用细胞松弛素B制备形成、由原生质膜和薄层细胞质所包围的细胞核或部分染色体的小原生质体。仅含部分染色体的微小原生质体一般来源于细胞核正处于分裂过程中的细胞。

③原生质球(spheroplast)：制备微生物原生质体时，具有残存的细胞壁但仍是圆球形称之为原生质球。

2原生质体分离 分离方法：机械法、酶解法

2.1 机械法：将叶肉细胞或其他细胞放在高渗蔗糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形。这时用剪刀剪碎组织，破坏细胞壁，使少量原生质体释放出来。缺点是产量低，而且无法从分生组织中分离得到原生质体。

2.2酶解法2.2.1材料来源及预处理

植物的各个器官，都可作为分离原生资体的材料，多选生长旺盛、生命力强的组织作为起始材料。肥水、季节、年龄和光照等影响原生质体产量和活力。 植物的幼嫩部分是制备原生质体的理想材料。幼叶、子叶、根和下胚轴。

叶肉细胞：可以分离出大量均匀一致的原生质体。选充分展开的叶片。

实生苗子叶和下胚轴：易消毒，种子萌发条件易控制，保证材料一致性。能提供大量发育同步的细胞。茄科：刚展开的无菌苗幼嫩叶片。十字花科：种子萌发4-5d的下胚轴。豆科：未成熟种子胚的子叶

试管苗：不需灭菌、重复性好。

愈伤组织或悬浮细胞：选用结构疏松并处于对数生长期的细胞分离原生质体效果较好。

用成熟叶片制备原生质体，需撕去下表皮，以便酶液与叶肉组织作用。单子叶植物表面常含硅，不易酶解。应选疏松易碎的愈伤组织或悬浮培养的细胞。

2.2.2 酶类 细胞壁由纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)和果胶质（pectin）等组成，相应的酶分纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

2.2.3材料预处理 改变细胞和细胞壁生理状态，增加细胞膜强度，提高酶解效率，减少原生质体损伤，提高原生质体活力和分裂频率。

①枝条暗处理 ②叶片萎蔫处理 ③叶片预培养 2.2.3材料预处理④预先质壁分离 ⑤胚性愈伤组织和悬浮细胞系的预培养

2.2.4酶溶液的配制 加入0.35-0.8mol/L葡萄糖、甘露醇或山梨醇等调节渗透压， 也可用原生质体培养基作溶剂配制，加入0.1~10m mol/L CaCl2， 0.75 mmol/ L KH2PO4和0.2-0.5％葡聚糖硫酸钾。少量AgNO3减少酶解的乙烯，过氧化物歧化酶减轻O2自由基对细胞膜的损伤，MES（吗琳乙基磺酸）作为pH缓冲调节剂。过滤灭菌.

2.2.5酶解处理 酶解前，撕去叶片和子叶下表皮，或切成小块，真空抽滤5-10 分，待组织中无气泡逸出为止，酶液充分渗入组织中，提高酶解效率。对于愈伤组织或悬浮细胞，先用筛网过滤以除去大的细胞团，留下较均匀的小细胞团进行酶解. 酶解处理原则：尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量有活力的原生质体。材料和酶液的体积比约1:10，每克材料用酶量10-20 ml。 酶解在24-28℃、黑暗、静止条件下进行，光照可引起细胞膜损伤，造成原生质体活力下降。酶解物在30-50 r/m振荡，促进原生质体释放。 酶解结束，用20-80μm筛网过滤除去未酶解的组织残余物。50g5min,收集原生质体，再用原生质体洗液或培养基洗2次，去残留的酶液。

2.2.6 原生质体纯化 供体组织经酶处理后，得到的是由未消化组织、破碎细胞、叶绿体、微管成分和细胞团以及原生质体组成的混合群体，纯化后才能进行培养

A.沉降法 利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。使用相对分子质量较小的甘露醇作为渗透压调节剂，

B.漂浮法 用相对分子质量较大的蔗糖作为渗透压调节剂，1000r10min，原生质体将漂浮于溶液的表面。

不连续梯度离心法

2.2.7原生质体活力测定

FDA法: FDA进入原生质体，受酯酶作用，分解形成荧光素。荧光显微镜下发绿色荧光的有活力，由于叶绿素关系，叶片、子叶和下胚轴的原生质体发黄绿色荧光有活力，红色荧光无活力。

B.酚藏花红染色法 加入溶液，终浓度0.01%，无活力的原生质体被染成红色

C.伊凡蓝染色法 0.025%溶液，受损细胞才能摄取这种染料。

D.形态观察法 颜色鲜艳，形态完整，富含细胞质，有活力。原生质体放入高渗或低渗溶液，观察涨缩情况。体积能随溶液渗透压变化而改变，即有活力.

E.荧光增白剂（CFW）染色法 CFW可结合于新合成细胞壁的p-糖苷上，400 nm激发光下产生绿色荧光。新制备的原生质体，如细胞壁分解完全，则原生质体周围看不到绿色荧光，培养过程中，有活力原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。 17

2.2.8影响原生质体数量和活力因素

①供试材料 选择旺盛分裂的材料、愈伤组织选淡黄色、颗粒状，选生长健壮植株上较幼嫩组织。

②酶的种类、组合和酶解时间 选择纯度高的酶类，根据材料胞壁特性及酶活性大小确定适宜酶液组合，低浓度，短时间处理。 ③渗透压稳定剂 一是由糖醇或可溶性糖组成，甘露醇或山梨醇，蔗糖。另一是无机盐溶液，由CaCl2、MgSO4、KCl等组成。优点是原生质体的产量比用甘露醇高；缺点是降低细胞壁降解酶的活性，高浓度的无机盐进入细胞内，影响培养效果。 ④ 质膜稳定剂 酶液中添加多聚阳离子和无机钙离子作为质膜稳定剂，如0.5~1.0%的葡聚糖硫酸钾或0.1%CaCl2·2H2O.钙能为膜蛋白所束缚，提高膜的钙含量增加质膜稳定性。葡聚糖硫酸钾能够抑制酶液内某些酶如RNA酶的活性，有助于质膜稳定 ⑤ pH 3 原生质体培养

3.1 培养方法A 平板培养B 滋养培养C 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的琼脂糖培养基切成块后放到大体积的液体培养基中，置于旋转摇床上震荡培养，以利于通气。促进原生质体的分裂及细胞团的形成。D 液体浅层培养

E.悬滴培养 将0.1ml左右的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿盖中。皿底加少量培养液保持湿度，将皿盖翻转过来盖于皿底上，膜封口后培养。 优点:所需材料少，生长快，易添加新鲜培养基，不易污染，一个培养皿可做多种培养基对照实验，可低密度培养。但分布不均，易集中在小滴中央。培养液易蒸发。可在液滴上覆盖矿物油。

微滴培养法 将0.1ml左右的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部，在6 cm培养皿中可滴5-7滴，密封后进行培养。可用倒置显微镜观察原生质体的发育过程，优缺点同悬滴法

固液结合培养 先把原生质体采用固体平板培养包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，密封后暗培养。 优点：原生质体分布均匀，有利于分裂；容易获得单细胞株系；细胞植板率高。但易受热伤害；易破碎。 液体浅层一固体平板双层培养法 在培养皿的底部先铺一薄层固体培养基，再将原生质体悬浮液加于固体培养基表面进行液体浅层培养。优点是固体培养基中的营养成分可以缓慢地释放到液体培养基中，培养物产生的一些有害物质，可被固体培养基吸收，更有利于培养物的生长。

3.3植板密度3.4培养基3.5培养条件 A.光照:新分离的原生质体：散射光或暗培养。叶肉、子叶和下胚轴等带有叶绿体的原生质体：弱光或散射光，由愈伤组织和悬浮细胞制备的原生质体暗培养。诱导分化：光培养

B.温度 25～30℃。分化：25～26℃

4原生质体的发育和植株再生 适宜条件下，原生质体先再生细胞壁，然后再生细胞进行分裂形成细胞团和愈伤组织，通过愈伤组织或胚状体途径获再生植株 4.1细胞壁再生

①细胞壁再生 培养数小时后原生质体开始再生细胞壁,一至数天内便可形成

②影响细胞壁再生的因素 材料种类、供体细胞分化状况以及培养基成分等。蔗糖>0.3 mol /L或山梨醇>0.5mol/L，抑制细胞壁形成。渗透压过高抑制细胞壁再生。 ③再生细胞壁鉴定 0.1%CFW染色、质壁分离、电子显微镜观察

4.2细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 适宜条件下原生质体培养2～3d后,胞质增加，细胞器增殖，RNA，蛋白质及多聚糖合成，不久发生核有丝分裂及胞质分裂 。六周形成直径1mm的愈伤

4.3植株再生 愈伤组织转到分化培养基上诱导器官形成或胚胎发生，长成完整植株。

4.原生质体融合4.1定义 通过物理或化学方法使原生质体融合，经培养获得具有双亲全部（或部分）遗传物质后代的方法，亦称体细胞杂交(somatic hybridization)

4.2 融合原理

①化学法融合 原生质体表面带有-10~-30mV的负电荷，相邻原生质体的质膜不可能紧密接触，而原生质体融和首先必须使两个原生质体紧密接触，质膜之间距离要<10?。由于PEG分子有带负电荷的醚键，具有轻微的负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，结果使原生质体发生黏连。 或带阴离子的PEG分子与

2+2+2+原生质体表面的阴离子间在Ca连接下形成共同的静电键，促进原生质体间的黏着和结合。 当用高Ca高pH清洗， Ca和

PEG分子被洗掉，打破了电荷平衡，使原生质体的某些正电菏与另一些原生质体的负电荷连接起来，进而促使原生质体的融和。 ②物理法融合 A：细胞膜的接触 当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，结果原生质体在电场作用下极化产生偶极子，使原生质体沿电场线运动，紧密接触排列成串 B：原生质体排列成串后，立即给予高频直流脉冲，使黏合相邻的原生质膜局部发生可逆性瞬间穿孔，两个紧密接触的细胞融和

4.3 融合方式

4.3.1 自发融合 酶解细胞壁过程中，由于胞间连丝的扩展和黏连，相邻的原生质体彼此融合，形成多核体（含2-40个核）。

4.3.2 诱发融合 不同来源的原生质体在NaNO3、高pH-高钙及PEG等诱导下融合。不同来源的原生质体融合形成的杂种原生质体叫做异核体。 (1) NaNO3处理 异核体形成频率不高 (2) 高pH-高钙处理

(3) PEG处理 异核体形成的频率高，可重复性强，形成双核异核体比例高。

4.4 融合程序

4.4.1 双亲原生质体的制备4.4.2诱导融合

①用移液管吸取混合亲本原生质体0.1-0.5 ml置试管内，或在小培养皿中滴成150ul的小滴。

②在试管内加入与亲本混合液等体积的融合剂 ③融合过程必须保温 ④保温结束后，用培养液或渗透压稳定剂洗去融合剂。

4.5融合类型和方法

①融合类型 分对称融合、不对称融合和微原生质体融合。a 对称融合 通过物理或化学方法，使种内或种间完整原生质体融合，产生核与核、胞质与胞质间重组的对称杂种技术原生质体融合后的个体称为融合体，同种原生质体间的融合称为同源融合，融合体称同核体；非同种原生质体间的融合称为异源融合，融合体称异核体。

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b 不对称融合 通过物理或化学方法处理亲本原生质体，使一方细胞核失活，或同时也使另一方细胞质基因组失活，再进行原生质体融合，获得只有一方亲本核基因的不对称杂种的技术。无核的亚原生质体称为胞质体，有核的小原生质体或只有核和原生质膜构成的亚原生质体称为核质体

c 微原生质体融合（微核技术） 以植物细胞经微核化处理后形成的、外包有被膜、内含一条或几条染色体的微核作为供体，与受体原生质体融合，从而实现部分基因组转移的技术。

②融合方法 分化学融合和物理融合。 a.器具灭菌 b.原生质体制备 c.制备PEG液和稀释清洗液。 d.融合 e.原生质体培养

4.6 融合产物的细胞学4.7融合体培养和发育

① 融合产物类型 异核体、多核体、同核体、异胞质体。异胞质体大多是由无核的亚原生质体与另一种有核原生质体融合而成。 ②融合体发育过程 a细胞壁再生 1-2d后融合体表面开始沉积纤维素微纤丝，进一步交织和堆积，几天后形成细胞壁。

b 核融合 异核体双亲细胞的分裂如果同步，进行正常有丝分裂产生子细胞，子细胞的核中含有双亲的全部遗传物质；否则一方染色体被排斥丢失，不能发生真正的核融合。c 细胞增殖 培养条件合适融合细胞继续分裂，形成细胞团和愈伤组织。

4.8体细胞杂种选择 融合产物是同核体、异核体以及没有融合的亲本原生质体的混合群体。

4.8.1杂种细胞的选择①互补筛选法 利用双亲细胞在生理或遗传特性方面所产生的互补作用进行选择。选择培养基上只有具互补作用的杂种细胞才能生长发育。②机械筛选法

4.8.2杂种植株的选择①形态学 ②细胞学 ③生物化学

4.8.2杂种植株的选择

5 细胞质工程（细胞拆合工程）

通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核、质的重新组合，重建成新细胞。

5.1细胞器基因组 核基因组、叶绿体和线粒体基因组

植物种质资源离体保存

1 概述

1.1 植物种质资源保存的重要性

1.2 种质资源保存方式 就地保存和异地保存（移地保存、种质库保存、离体保存等）。就地保存耗费巨大的人力、物力和土地，易受自然灾害、病虫害侵袭

种植保存和种子保存：①种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失；②无性繁殖的植物难于采用； ③ 采用无性繁殖来保持其优良性状的植物，用种子繁殖后代会发生变异； ④ 顽拗型种子(不耐干燥和低温，如水生植物水浮莲；木本植物可可、椰子、菠萝蜜、芒果、板栗、山竹等)植物：种子含水量高，不能忍受干燥，仅能存活几周或几个月，很难长期保存，不宜用种子保存或保存难度很大； ⑤ 易遭自然灾害袭击而丢失。

种质资源的离体保存 对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。

优点：①占空间少，节省人力、物力和土地； ②便于交流；③ 需要时可以离体快繁；

④ 避免自然灾害引起的丢失。

不足：① 限制或延缓生长处理，需定期转移继代；② 易受微生物污染或发生人为差错

③ 多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的老化和再生能力丧失

2 限制生长保存 通过低温、提高渗透压、加生长延缓剂、干燥等措施限制离体培养物的生长速度来保存种质的方法。 原理：即严格控制某种或某几种培养条件，限制培养物的生长。

注意：① 为降低水分蒸发，要注意贮存容器类型和密闭方式；

② 有较大变异可能性，定期进行细胞学、遗传学和生产性状鉴定。

2.1低温保存2.2 高渗透压保存法2.3生长抑制剂（或延缓剂）保存2.4 降低氧分压保存

3 超低温保存 将植物的离体材料包括茎尖、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮或-80℃以下）条件下进行保存的方法。

3.1 基本原理 离体种质经一定方法处理，然后保存在液氮中。所有的细胞代谢活动、生长都停止了，排除了遗传性状的变异，保存了细胞的活力和形态发生潜能。

措施：① 选择细胞内自由水少、抗冻能力强的材料；② 预处理提高材料抗冻能力；③ 在冷冻过程中尽量减少冰晶的形成，避免组织细胞过度脱水；④ 在解冻过程中避免冰晶的重新形成以及温度冲击导致的渗透冲击等。

3.2超低温冻存的细胞学基础

3.2.1 细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键

植物细胞含60~90%的水分。由游离水和束缚水组成，游离水约占90%，容易冻结。

冻结温度：细胞外水-5~-15℃，游离水-25℃。-30℃时，细胞几无非冻结状态的游离水存在，结合水在-100℃也不冻结。

3.2超低温冻存的细胞学基础

细胞游离水的冻结温度（-30℃）是细胞冻存的安全温度，细胞冻存的两步冻结法是以-30℃为基础。控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。

3.2.2超低温保存过程中的致死损伤

超低温保存步骤：①细胞预冻；②细胞在-196℃下长期贮存；③细胞解冻。通常细胞在-196℃下贮存是安全的，而在预冻和解冻期间发生致死损伤的可能性更大。超低温保存成功的关键是降温冰冻过程中避免细胞内结冰。降温过程中使细胞适当脱 19

水，使细胞内的水流到细胞外结冰，在化冻过程中防止细胞内次生结冰

超低温保存方法

含培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻、细胞活力和变异的评价及植株再生等

人工种子 将离体培养产生的体细胞胚包埋在人工种皮、人工胚乳中，在一定条件下能发芽出苗的颗粒体。 或任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整植株，均称之为人工种子。

人工种子分类 根据包被需要程度分3类：

① 裸露的或休眠的繁殖体，如适当干燥的体胚、休眠微鳞茎和微块茎等，不加包被情况下也具有较高成株率。 ② 人工种皮包被的繁殖体，一些体胚、原球茎等不能过度干燥，但只需人工种皮包被即可维持良好的发芽状态；

人工种子分类

③ 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 多数体胚、不定芽、茎尖等需先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，维持良好发芽能力。

根据繁殖体的类型分：体细胞胚人工种子和非体细胞胚人工种子。

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