本科学生综合性实验报告

学号： 104120281 姓名： 李胜美

学院： 生命科学学院 专业、班级：10应用生物教育B班 实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞

悬浮及体细胞胚胎发生培养实验

教师： 杨 世 忠

开 课 学 期： 2012 至 2013 学年 第二 学期 填 报 时 间： 2012 年 6 月 20 日

云南师范大学教务处编印

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

15

 

第二篇：植物组织培养实验报告

植 物 组 织 培 养

实验报告

学院:生命科学技术学院

班级:10生技植物班

学号:XXX

姓名:XXX

植物组织培养实验报告

一、实验目的

1．掌握无菌操作的植物组织培养方法；

2．通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；

      3．通过诱导豌豆根、茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法；

4．通过诱导豌豆茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法；

      5．了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育, 最终长成完整再生植株的过程, 加深对植物细胞的全能性的理解。

二、实验原理

   （一）植物组织培养

    植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。

   （二）植物细胞的全能性

      植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。

   （三）组织的分化与器官建成

 外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织即具有分生能力的小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。

   （四）培养基的组成

培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳条件相近，似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。

三、实验器材

高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室  镊子、记号笔、橡皮筋、玻璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。

四、实验材料

     豌豆种子

五、实验药品

      药品 、70% 酒精、 0.1% 升汞、MS培养基、蒸馏水、NaOH、  84消毒液、蔗糖、琼脂等。

六、实验步骤

   （一）培养基母液的配制

表1.MS培养基个成分的含量（单位：mg/L）

表2.MS培养基所需母液以及扩大倍数

（注：吸取毫升数为每升培养基所吸取的母液的体积）

表3.配制母液所需的药品及称取量

（注：根据表1与表2计算各物质的称取量）

（1） MS大量元素母液的配制

      参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰箱中备用。

（2） MS微量元素母液

      参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰箱中备用。

（3） MS有机母液

      参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至200ML存放于冰箱中备用。

（4） MS铁盐母液的配制

      参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰箱中备用。

（5） MS钙盐母液的配制

      参考表3称取11000mg的CaCl2•2H2O用蒸馏水溶解定容至500ML，保存于冰箱备用。

（6） MS镁盐母液的配制

     参考表3称取9250mg的MgSO4•7H2O用蒸馏水溶解定容至500ML，保存于冰箱备用。

（7） MS肌醇母液的配制

      参考表3称取2000mg的肌醇用蒸馏水溶解定容至200ML，保存于冰箱备用。

（8） MS激素母液的配制

       各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

（二）培养基的配制

     以配制1L的MS培养基为例进行如下操作：

（1） 取1L的大烧杯，加入适量的蒸馏水在电磁炉上加热至沸腾；

（2） 分别取（一）中配制的8种母液放入小烧杯中，然后加入，边加边搅拌；

（3） 称取30g蔗糖加入，边加边搅拌；

（4） 称取8g琼脂加入，边加边搅拌，知之琼脂粉溶解；

（5） 定容至1L，加入激素母液，用NaOH调PH6.0左右；

（6） 将培养基分别分装于洗好的三角瓶中，塞上棉塞包上牛皮纸用绳子扎紧；

（7） 放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右；

（8） 灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

（三）高压蒸汽灭菌锅的使用方法

            具体操作步骤：

（1） 高压锅放水至平把架；

（2） 把包扎好的培养基装入高压锅；

（3） 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；

（4） 然后接通电源；

（5） 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)；

（6） 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟；

（7） 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出；

（8） 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。

      总结：高压灭菌锅的使用方法可归纳为：进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。

（四）、无菌操作技术

          1、植物材料表面——消毒剂灭菌

从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。

      2、接种步骤：

第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗

        →→自来水冲洗；

第二步：对材料的表面浸润灭菌 ： 70%酒精浸10-30秒→→无菌水；

第三步：灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂） ；

第四步：无菌水进行冲洗。

     注意事项：

（１）灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存；

（２）对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗３-４次，升汞一般５-８次，每次不少于３min；

（３）灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底；

（４）灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止；

（５）灭菌液要充分浸没材料。

      3、无菌操作可按以下步骤进行：

（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；

（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；

（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；

（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；

（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；

（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

（五）豌豆的萌发与豌豆外植体的接种

1、准备 打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照 20min后关闭紫外灯，同时将豌豆种子用自来水冲20min关闭紫外灯后在台上点燃 2 个酒精灯，用棉球将镊子烧4次，超净作台少2次。将灭菌溶液，无菌水， 豌豆，大烧杯等放入超净工作台。

2、灭菌 在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用酒精倒入种子瓶中约2／3消毒一次（1-2s）接着用无菌水冲洗一次。再用84 消毒液摇晃清洗清洗 3 次，每次 5 分钟，清洗完后用无菌水冲洗一次。而后用 0.5%HgCl 泡8min，处理 2 次，每次 5 分钟。后用无菌 水摇晃清洗 4-5次。

3、接种 将所要用的三角瓶用75％的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入超净工作台。接着将灭菌处理好的豌豆种子在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入向下倾斜的锥形瓶杯中，每个瓶内装 4 粒豌豆，接种过程中锥形瓶应一直保持向下倾斜，直到接种完毕盖上棉塞，贴上标签，放入光照培养箱中。一周后挑选长势较好的幼苗用同样的接种方法将外植体接入三角瓶中，贴上标签，放入暗处。（注：接两瓶茎两瓶叶，茎剪成0.5厘米左右的小段，将茎上的叶片剪干净，平铺在培养基上；叶片成0.5*0.5用镊子破碎，平铺在培养基上。）

4、标记 接种完毕后，用棉线绑好用铅笔在牛皮纸标上制作人和日期，放入有光的培养架上。

5、定期观察种子的萌发情况和外植体的分化情况，记录种子的萌发率、污染率以及愈伤组织的诱导率。

     种子的萌发率为：83.3%   种子的污染率：0%

    外植体的污染率：100%    愈伤组织（茎）的诱导率：100%

     愈伤组织（叶）的诱导率：100%

6、定期观察，并纪录实验结果。（实验结果见图1）

  注：实验人员进入接种室接种之前，应先接种前一定要用新洁尔灭等消毒水擦拭，70%~75%酒精进行喷洒杀菌降尘，
  其次一盏酒精灯也是必不可少的，不管是开母苗之前还是接种过程或是开关子瓶培养基，都应该在酒精灯上操作。
  操作过程中所有的动作都应尽量的小幅度，特别是不能横扫所有灭过菌的东西，如：消过毒的镊子、手术刀、培养皿等；接苗是手指不能接触到瓶口，如果镊子不小心碰到瓶口或台面那就不要犹豫，直接换掉；分切的整个过程动作要快，时间越长越容易污染。
 

图1实验结果

（六）实验结果分析

      在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。植物组织培养不仅仅局限于培养基的培养，还包含有试管苗的移栽技术。

      通过组织培养得到的植物体的特点：组织培养得到的植物体的遗传物质与原植物体的遗传物质完全相同，表现出的性状完全一样（排除基因突变等情况）。需要注意的是如果用亲本的花粉进行组织培养，那么得到的植株会是单倍体，单倍体的遗传物质自然也就比用体细胞培养的植株的遗传物质减少一半。植物组织培养的实质是：基因的选择性表达

      在后期的愈伤组织的脱分化在生根的过程中应考虑愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关；愈伤组织再生成完整植株有几种方式；怎样尽量避免出现褐变和玻璃化苗；试管苗驯化中应注意调节什么因素；如何估测增殖率；如何安排快速繁殖计划等一系列的问题。