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植物细胞组织培养技术

实验指导书

中国计量学院生命科学学院

二零零六年七月

《植物细胞组织培养》实验指导

目        录

实验一、植物组织培养培养基母液的配制

实验二、植物组织培养的培养基配制

实验三、康乃馨的离体快繁

实验四、胡萝卜愈伤组织的建立

实验五、组织培养物的继代培养

实验一  组织培养基母液的配制

一、仪器及药品

         冰箱、天平（0.0001g）

容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml

广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml

烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml

数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺

         标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH

几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品

蒸馏水

二、方法和步骤：

按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N₆培养基各种母液的配制步骤如下：

大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N₆培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml或50 ml。

微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成 100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N₆培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。

铁盐：在N₆培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO₄?7H₂O）2.78 g和乙二氨四乙酸二钠（Na₂-EDTA）3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N₆培养基需加该铁盐母液5 ml。

有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。

植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、 萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后 ,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含 0.1-2 mg，配制培养基时按所需要的量分别加入，本实验中的2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液。

在配制吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1 mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。

       　　表1　　N₆　朱至清(1975)培养基配方

各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1 L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。

三、注意事项

1.      如药品所带结晶水不同，应进行换算。

2.      因常用的MS培养基中硝酸铵(NH₄NO₃)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本实验采用N₆培养基替代MS培养基。

实验二 培养基的配制

一、仪器设备及试剂

电炉

天平（0.0001 g）

高压灭菌锅

量筒：l0 ml、20 ml、100 ml、500 ml

烧杯：1000 ml、500 ml、250 ml

移液管：1 ml、2 ml、 5 ml

吸管若干、记号笔

三角瓶或试管、试管架

锡铂纸、玻璃棒

配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。

蒸馏水、pH试纸

蔗糖、琼脂 等

          1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl溶液 。

  二、方法和步骤

1 量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基, 先量取约700 ml体积的水。

        2 根据培养基配方， 用量筒量取所需要的各种元素的母液。

吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如本实验中培养康乃馨侧芽或茎段时就加入1ml的1 mg/ml的6-BA；而另一个实验胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1 mg/ml的2,4-D。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。

      3 调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定

培养基的pH按照培养材料的要求分别用       1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。

4 分装   将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。

          5 培养基的灭菌   一般用手提式医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采用全自动高压灭菌锅。

6 培养基的保存   消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般 应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。

三、注意事项

激素应在调节pH之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响培养质量。

在本次实验中将下次实验所需的其它材料一同灭菌处理。

实验三  康乃馨的离体快繁

一、仪器设备和试剂

超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水

培养基  N₆+1 mg/L 6-BA

剪刀、枪型镊子

量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子

95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔

纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶

植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试管苗等

二、实验材料   康乃馨枝条

三、方法和步骤

1 外植体灭菌  取从市场上购买的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗 30-60分钟，然后在无菌室（超净工作台）内用70%酒精浸没20-40秒钟（根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间。用0.2% 的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。

2 接种   先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。

超净工作台消毒   开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70% 的酒精棉球擦净工作台。

接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。

3 培养条件： 25℃光照13小时/天 光强1000 Lux

4 继代培养（见下一个实验）

5 诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N₆培养基诱导生根

       6 试管苗移栽〈参见有关其它实验〉

实验四 胡萝卜愈伤组织的建立

一、 材料和设备

超净工作台或者无菌接种室

培养基 N₆+2 mg/L 2,4-D

带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水

解剖刀、枪型镊子、刀片

无病虫的胡萝卜直根数十个

消毒剂  0.2%的升汞溶液

70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球

l000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔、小刷子（可用一次性牙刷）

二、实验材料  新鲜胡萝卜、胡萝卜愈伤组织

三、实验步骤'

         1 选择无伤、无病、形状较规则的胡萝卜，用小刷子在流动的自来水下洗刷胡萝卜，除净表面所有的泥屑。可以根据实验的时期，选用其它的实验材料。

         2 将胡萝卜切成大约 40 mm厚的片段,放入100或500 ml的烧杯中，倒入消毒液，将植物材料覆盖、浸泡10-30 min。在灭菌过程中，在每个材料上做好标记，并对应地放在预接种的培养基边上。接种后在培养瓶上标明培养物名称和培养日期。

        3 在超净工作台上，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5次，以便去除残留的消毒液。

4 取消毒过的胡萝卜放入已灭菌的带有滤纸的培养皿中，用无菌解剖刀从两端各切去10毫米，再将留下的胡萝卜直根切成一系列一毫米厚的横切片。取其中的一片转到另一个已灭菌的带有吸水纸的培养皿中，再将每一片切成小块，使其每个小块上均包含木质部、形成层和韧皮部，外植体的大小要尽量一致。

5 接种  取下培养瓶的塞子（或锡铂纸），用火灼烧瓶口2 cm处，手持培养瓶呈45º角，用消毒镊子把4-8块外植体转到琼脂培养基的表面，注意把靠近根尖的一面接触培养基。然后立即将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口。每两次转移之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌。

   6 培养  接种好的外植体在25℃的培养箱中，黑暗条件下培养四周左右就会形成一块较大的愈伤组织。

实验五 组织培养物的继代培养

一、材料和设备

材料 从培养4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体

超净工作台

培养基　N₆+0.5 mg/L 2,4-D  N₆+2 mg/L 6-BA（也可以自已设计）

三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀

70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球

酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶

二、方法步骤

1 取材  在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶培养物，灼烧培养瓶口约20 毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培养皿中。每个培养皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织。把每块愈伤组织分成两、三个不小于5 mm见方的小块。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状,不适宜作继代培养。这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。每次操作后要去掉用过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。

2 继代转接  将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上，接种方法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。长期培养的胡萝卜组织会产生大块愈伤组织。正在发育的愈伤组织作第一次继代培养所用的实验程序与以后每隔四周转移一次建成愈伤组织系的继代培养程序相同。

3 实验记录 将实验记录抄录于笔记本上，注明实验开始的日期、持续期、培养物的数目、污染数目和所作的不同处理。在四星期内，每隔一星期用肉眼观察培养物，记录培养物形态的变化,培养物的生长状态、鲜重变化等，必要时作拍照记录。

思考题及作业：

1 愈伤组织是从刚分离的外植体的哪些区域起源的？

2 所有的外植体的生长速率都相同吗？

3  根据每组的实验结果撰写一份完整的实验论文形式的实验报告，实验报告将作为平时成绩记入总成绩。

 

第二篇：植物组织培养技术实验指导书

 

 

《植物组织培养技术》实验教学准备工作

一、  配制母液所需药品、器材

1、 Ms成分19种（N6同）

2、蔗糖

3、琼脂

4、激素（NAA、6-BA、IBA、IAA、KT、ZT等）

电子天平、（试管）、容量瓶、烧杯、称量瓶、吸水纸、角匙、母液瓶（棕色）、蒸馏水

二、无菌室所需物品

1、95%酒精、70%酒精、新洁尔灭、甲醛、高锰酸钾、紫外灯、工业酒精

2、枪式镊子（16 cm,20cm）、尖镊（16cm）、解剖刀、柄、接种针、手术剪、喷雾器、 药棉、纱布、火柴

? 3、 广口瓶若干、酒精灯、漏斗、无菌培养皿

三、学生配制培养基、分装、高压灭菌所需器具

1、培养瓶（PP,120ml三角瓶）(15mm*145mm试管)

2、电炉

3、烧杯（1000ml）移液管（ 10ml、5ml、2ml、1ml）、吸球

4、量筒（100ml、50ml）、角匙、天平、剪刀、吸水 、纸

5、pH值精密试纸（5.4-7）

6、氢氧化钠、盐酸（1N）、蒸馏水、牛皮纸、棉绳

7、试剂瓶、（激素、酸碱）、滴管、标签、玻棒

四、消毒剂（处理外植体）

升汞（氯化汞）、酒精、漂白粉、双氧水、次氯酸钠

实验一、 Ms培养基的配制、分装和灭菌

    植物组织培养的成功与否，除培养材料本身的因素外，第二个因素就是培养基。应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。
    另外植物组织培养是 在无菌条件下培养植物的技术。要达到无菌操作和无菌培养，必须有一定的无菌环境（高压灭菌，无菌室，超净工作台等），使用无菌的容器和用具，进行无菌操作，使培养的植物材料在一定的温度、湿度、光照、营养条件下，生长、发育和繁殖。  
一、目的要求
        学习常用培养基母液的配制方法、培养基的分装和灭菌技术
二、实验用品
   1、仪器?

  高压灭菌锅、天平、电炉
   2 、玻璃器皿? 烧杯、量筒、移液管、、玻棒、吸球、培养瓶、培养皿、500ml三角瓶、角匙、吸水纸
   3、药品与试剂? 
     Ms母液（见表1-1）
   氢氧化钠1N、盐酸1N、蔗糖、琼脂、2，4-D（1mg/ml）、NAA（1mg/ml）、蒸馏水
三、实验方法
（一）、培养基的配制
     配制培养基前要先配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四大类。（用量详见 表1-1）。
1、大量元素母液（20倍液）
      分别称取20倍用量的各种大量无机盐，要一种药品完全溶解后加入下一个药品，依次溶解于约600ml热的（50ºC）蒸馏水中。（CaCl2.2H2O ）另外溶解后与前溶解的药品，加水定容至1000ml装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。
2、微量元素母液（100倍）

附表1-1                                     

MS培养基母液的配制    (单位：mg)

分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于约600ml重蒸水中，加水定容至1000ml。冰箱内贮存备用
3、铁盐母液（ 100倍）
      称取100倍用量的Na2.EDTA（乙二胺四乙酸钠）、FeSO4.7H2O
溶于600ml重蒸水中，加水定容至1000ml。冰箱内贮存备用。
4、有机物质母液（ 50倍）
     分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至500ml；装入棕色瓶中贮存于冰箱里。
5、生长素
      如2，4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml 95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，放入水箱备用。
6、细胞分裂素
     如激动素（Kt）、6-苄基嘌呤（6-BA）。准确称取20mg先用2ml 的1mol/LHCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，放入水箱备用。

二、培养基的配制与分装
        取1000ml烧杯一只，加大量元素母液（1）50ml，微量元素母液（2）10ml，铁盐母液（3）10ml， 有机物质母液（4）10ml。
  此外，还需添加2，4-D 2ml/L、NAA 1ml/L、蔗糖30g/L等、然后加水至1000ml，待蔗糖充分溶解后用1mol/L HCl或NaOH调整PH5.8,最后加入琼脂粉4-4.5g/L或琼脂条7-10g/L加热至琼脂完全融化。趁热分装到培养瓶中,每瓶约30ml,分装时避免把培养基倒在瓶口上,容易引起杂菌污染。
三、培养基的灭菌
      把装好培养基瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，加水，设置温度121ºC时间20分钟,加热至108ºC时放气，排出锅内冷气。等到灭菌后冷却取出放置培养室凝固备用

四、注意事项
      配制好的母液应分别贴上标签，在2-4ºC的冰箱中贮存。
 MS母液贮存要求严格，贮存时间不宜过长，在一个月内用完。培养基也是，如发现霉菌和沉淀产生就不能使用。 配制好的培养基要趁热分装，及时灭菌，以防污染变质。
    灭菌过的培养基凝固，是顏色正常的培养基   
    半凝固，颜色变深：灭菌时间过长或压力过高
    半凝固，颜色正常：pH值太低
    如有污染：霉菌或细菌是因灭菌时间或压力过低，或容器破损，         
或封口不严。
五、实验结果分析

实验二、    花药培养

    器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体进行离体培养，是植物组织培养中最主要的一个方面，进行的植物种类最多，应用的范围也最广。花药培养是指将植物体雄蕊的花药离体接种在一定的培养基上，使其产生花粉单倍体植株的技术。

一、实验目的
    学会花药发育过程中,不同发育时期的确定,掌握花药培养预处理技术以及消毒和花药离体培养的无菌操作技术；了解植物花药培养的一般方法和步骤。

二、实验主要内容

    1、MS培养基配制          2、花药的获取和预处理技术；
    3、消毒和无菌操作        4、诱导过程中的形态学和细胞学观察

    生长素：2，4-D、NAA（萘乙酸）促进花药愈伤组织形成

三、实验材料

     水稻选择剑叶叶枕抽出距下一叶，也枕约为4-6CM的孕穗稻。单核中期（诱导效果好）的水稻花药。

（单核中期：此时水稻颖花有如下特征——雄蕊长度大于颖壳长度的1/3而接近其1/2，颖壳宽度已达到最大值，但颜色为浅黄绿色）

预处理：
带花梗的水稻穗用湿纱布包裹后再套一塑料袋，于7-10℃冷冻7-14天。——可提高诱导效果。

四、仪器、试剂及培养基

     冰箱、天平、高压灭菌锅、无菌室、 超净工作台、酒精灯、镊子、解剖刀、无菌培养皿

   工业酒精、75%酒精、95%酒精、药品（N6基本培养基母液、2，4-D(1mg/L)、NAA(1mg/L)）

培养基： N6+2,4-D(2mg/L)+NAA(1.5mg/L)+蔗糖(5%)+琼脂(5%)，PH5.8（提前配制好的）

五、实验内容及方法、步骤

     配制N6培养基（各小组已提前配制好）见表

无菌操作前的准备工作
1.无菌室的消毒、灭菌
   无菌室必须定期打扫，清扫后须用0.1％的新洁尔灭溶液擦拭超净台和桌椅表面，同时拖净地面。
  每周末须用甲醛熏蒸无菌室，并用紫外灯照射无菌室过夜。
  每次无菌实验前须将紫外灯开启，照射30分钟以上后关去紫外灯，并使超净台通风15分钟后方可使用。
 2、消毒.接种
      取单核期花药（7-10°C冷藏7-14天的稻穗）表面用70%酒精棉擦拭。取花药接种于N6培养基表面与培养基紧密接触    27°C暗培养，诱导愈伤组织
五、结果与讨论（1周后）
 1、如培养基无污染 ：花药黄色或米色（暗培养）、花药绿色（光培养）。花药变黑色 ，镊子冷却不够，烫死属正常现象。
 2、如培养基污染：发现水渍状，米黄色或红色、黄色、是细菌污染—原因是呼吸，接种物交叉。
    发现白、灰、黑色毛状物，真菌性、霉菌污染– 是空气中孢子 

 

实验三  茎段培养

茎段培养指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养茎段主要的目的是快繁。其次也可探讨茎细胞的生理特点，以及进行育种上的筛选突变体的过程。
    茎段培养用于快速繁殖的优点在于：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。
一、目的
      掌握外植体的选择、切取和消毒技术，学会无菌接种和培养方法
二、内容
         1、外植体的获得
         2、外植体的清洗、消毒
         3、无菌接种培养
         4、培养基配制
三、仪器、药品
         小烧杯、大烧杯、剪刀、镊子、培养皿、无菌水、超净工作台、70%酒精、Ms培养基（IBA 0.5mg/l,6-BA 2ml/l）
四、实验步骤
 1、材料的选择和处理   

 

取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，若是木本，取当年生嫩枝或一年生枝条，剪去叶片，剪成3-4CM的小段。在自来水中冲洗，在于无菌条件下用75%酒精灭菌30-60秒， 再用饱和漂白粉液浸泡10-20分钟，或0.1%升汞8min左右或2%次氯酸钠10min左右。最后用无菌水冲洗数次，无菌水冲洗3-4次因材料老嫩和蜡质多少而定时间。以备接种。

2、培养  

    

 最常用的基本培养基为MS培养基，加入3%蔗糖，用0.7%的琼脂固化。培养条件保持25℃左右， 给予充分的光照和光期。一般 25°C条件下培养 1000-3000lx。经培养后茎段的切口特别是基部切口上会长出愈伤组织，呈现稍许增大，而芽开始生长，有时会出现丛生芽，从而得到无菌苗。

五、结果讨论与分析

1、霉菌污染：培养基上    空气中孢子落入外植体上，消毒不彻底

2、细菌污染：呼吸及接种时交叉污染

3、无污染：生长良好

                    

实验四    叶片培养

    离体叶培养包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。 叶是植物进行光合作用的自养器官，又是某些植物的繁殖器官，因此叶培养不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题，而且也是繁殖稀有名贵品种的有效手段。

一、目的要求

        掌握植物叶片的表面消毒技术，外植体创口获得和愈伤组织的诱导过程。

二、内容

  1、培养基的配制  Ms+NAA1毫克/升+2,4-D1毫克/升+BA2毫克/升╋琼脂粉5g+蔗糖30g，pH 5.6

  2、植物叶片的清洗、消毒和外植体创口获得和愈伤组织的诱导过程

  3、创口效应

三、仪器、药品

        大小烧杯、剪刀、镊子、无菌培养皿、无菌水、超净工作台、70%酒精棉、Ms培养基

四、实验步骤  

 1、材料选择及灭菌    ：

      取植物的幼嫩叶片自来水冲洗，清洗蒸馏水干净，用70%酒精漂洗约10秒，再在饱和漂白粉液中浸3-15分钟或0.1%升汞8min左右，用无菌水冲洗数次，再放在无菌的干滤纸上吸干水分以供接种用。对一些粗糙或带绒毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。一般地说，同一叶片的栅栏组织比海绵组织处于较成熟状态。在培养叶肉时因为海绵组织在分裂前就死亡，如果栅栏组织不发达的话就难于培养。

2、接种： 

在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。把灭菌过的叶组织切成约0.5CM （叶片>5mm2）见方小块或薄片（如叶柄和子叶），接种在MS或其他培养基上。叶背紧贴培养基

注意：

外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。

3、培养  ：

   叶接种后培养条件为每天10-12小时光照，25°C条件下培养光强1500-3000lx。培养约2周至4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。

    这时应转移到再分化培养基上进行分化培养，分化培养基的细胞分裂素含量为2毫克/升左右，约10天左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点，它将发育成无根苗。

叶的培养比胚、茎尖和茎段培养难度大。

首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。

其次要添加适当的生长素和分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。

五、结果与分析

1周后观察到叶片拱起，2周后观察到伤口处有致密的小突起。1月后观察到伤口处被块状的愈伤组织所包围或覆盖，其创口处的细胞经外源激素的诱导，具有分生能力的分生组织，因此叶片的伤口处的细胞不断分裂形成了愈伤组织。

实验五   胚胎培养

    植物胚胎培养是胚及胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。
一、实验目的

        掌握胚胎培养方法及培养技术。掌握水稻种子表面消毒技术胚胎的获得和愈伤组织的诱导过程。

二、实验内容

        1、培养基配制，

        2、水稻种子的清洗、消毒和胚胎的获得同上

        3、创口效应，外植体的消毒，胚胎的培养方法及技术

三、仪器、药品

大小烧杯、剪刀、镊子、无菌培养皿、无菌水、超净工作台、70%酒精棉、Ms培养基加入2，4-D或NAA 0.5-2毫克/升。
四、实验步骤           

    由于水稻种子外部有较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精1分钟的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，或 0.1%升汞1小时， 无菌水冲洗5次然后在无菌条件下进行解剖剥取种胚胎，取出胚并接种在培养基上培养。 在温度25-27℃和黑暗条件或散射光下培养，约6-10天胚乳开始膨大。

五、结果与分析       

实验六      茎尖培养

    茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。这是组织培养中用得最多的一个取材部位。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。微茎尖指带有1-2个叶原基的生长锥。其长度不超过0.5毫米。普通茎尖指较大的茎尖（如几毫米到几十毫米）、芽尖及侧芽。

一、目的要求

    掌握马铃薯（含笑）无菌苗的培养方法和茎尖的切取技术，并在特定的培养基中获得脱毒苗。

二、内容

     1、培养基的配制

     2、马铃薯表面消毒和无菌苗的培养

     3、茎尖的切取技术

     4、无菌脱毒苗的获得

三、仪器、药品

大小烧杯、剪刀、镊子、无菌培养皿、无菌水、超净工作台、70%酒精棉、培养基Ms+BA（2ml）+NAA(0.2ml) +活性炭2g/L 、大量不定

四、实验步骤

（1）取材  

   

 挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。木本植物可在取材前对茎尖喷几次灭菌药剂。以保证材料不带或少带菌。用于普通茎尖培养，可先从植物的茎、腾或匍匐枝上切取2厘米以上的顶梢。（尽量取树木基部枝条、嫩枝或萌发枝）         

（2）消毒接种   

     将采集到的茎尖切成0.5-1厘米长，并将其大叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。将茎尖置于流水冲洗，再在75%的酒精中处理30秒，然后在0.1%升汞浸泡5-8分钟或稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8分钟，最后在超净工作台用无菌水冲洗数次剥取顶芽、切取1-2个叶原基的茎尖用无菌水冲洗，准备接种。
 （3）接种   

为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为0.5厘米左右大小。这样取茎尖大小只能作为快速繁殖。有些植物的茎尖由于多酚氧化酶的氧化作用而变褐。所以在接种时，不能再用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时间，也可配置1%-5%VC液，将切下的茎尖材料浸入处理一下。培养条件25°C,2000lx,12h·d-1。一般茎尖培养在40天左右可长成新梢，进行继代培养。

五、结果分析

     2周后观察到茎尖开始膨大，说明茎尖的生长锥细胞在外源激素的刺激下不断分裂，使茎尖长大。茎尖切取大小影响其生长，发现大于5mm的长成芽，小于5mm的分化为愈伤组织。

茎尖在培养过程中会出现生长太慢，生长太快和生长正常三种类型。引起生长太慢的原因是生长素浓度太低，或是温度过低或过高；生长太快的原因一是生长素浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。二是光照太弱或温度太高。生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。
六、根据自己的培养结果分析

实验七     愈伤组织的转接培养

一、目的要求

           掌握愈伤组织的生长情况和转接要点，获得数量更多的继代愈伤组织

二、内容

         1、培养基的配制

          2、愈伤组织的转接培养

三、药品、仪器

        无菌操作台、酒精灯、镊子、解剖刀或手术剪刀、70%酒精、工业酒精、95%酒精、无菌培养皿（N6培养基）

1升  [N6+2，4-D（2mg/l）+NAA(1.5mg/l)+蔗糖50g+8-10g琼脂]    pH5.8

Ms培养基[BA（1mg·l-1）+NAA(0.1mg·l-1)]

四、方法与步骤

         愈伤组织块切块，转接于培养基中（均匀分布） 25°C温度培养，光照1000-2000lx ，12-16h·d –1。                            

五、实验结果分析与讨论

      1周后观察愈伤组织块很快长大，而且颜色绿色较鲜艳，

   二周后愈伤组织块生长较原来二倍大。

实验八  再生植株诱导

一、目的要求

      掌握从愈伤组织到再生植株的有的技术及试管苗的生产和移植技术。

二、内容

    1、分化培养基的配制

    2、愈伤组织器官发生技术

    3、观察、记载和移植

三、药品、仪器

       无菌操作台、酒精灯、镊子、解剖刀或手术剪刀、70%酒精、工业酒精、95%酒精、无菌培养皿（N6培养基）1升  [N6+2，4-D（2mg/l）+NAA(1.5mg/l)+蔗糖50g+8-10g琼脂]  pH5.8

培养基：Ms+NAA（mg/L）+IAA(0.5mg/L)+KT(2mg/L)+3%蔗糖+0.8%琼脂

四、方法步骤

将水稻花药愈伤组织（米粒大  转入分化培养基诱导植株分化            3-5天暗培养  光强1000-2000lx ,14h光照，27°C左右

五、结果与分析

         (分化培养基上陆续出现绿苗)播种一周观察，分化培养基的愈伤组织有绿色出现。第二周有的愈伤组织转绿色，并有白色