食品微生物学实验、实训指导

       食品教研室、生物教研室组织编写

(内部使用)

漯河职业技术学院轻工系

食品加工技术专业使用

20##年12月

实验室安全守则

1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。

2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。

3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。

4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。

5.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。

6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是否正常，并认真记录。关好门窗，方可离去。

实验室检验总则

一、样品的采集

（一）采样目的

确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。

（二） 采样原则

1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。

2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。

3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。

（三）采样数量

取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200g。

根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。

（四）采样方法

1．采取随机抽样的方式。

2．直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。

3． 如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0－4℃。

4．不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。

5．在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。

（五）样品的保存和运送

1．样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。

2．冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在0－5℃冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。

3．运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。

4．待检样品存放时间一般不应超过36小时。

二、检验样品的制备

（一）样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

（二）检验冷冻样品前应先使其融化。可在0－4℃融化，时间不超过18小时，也可在温度不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟。

（三）检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速翻转25次；如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3min。

(四)开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75％乙醇消毒开启部位及其周围。

1．非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。

2．粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。        

3.固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。

三、检验

（一）实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。

（二） 检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。

（三）实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。

（四）制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。

（五） 检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。

四、检验记录和结果的报告

（一）经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

（二） 检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。

                                     实验一       普通光学显微镜的构造和使用

一、目的与要求

（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。

（二）学习并掌握油镜的原理工科使用方法。

二、原理

普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。

三、材料与仪器

（一）菌种  金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。

（二）其他   香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。

四、操作步骤

（一）显微镜的安置   置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm，镱检时姿势要端正。

（二）调节光源   安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

（三）低倍镜观察  将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。

（四）高倍镜观察  在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。

（五）油镜观察  在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2厘米，然后在待观察区域滴加1—2滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

（六）显微镜用后处理

1、上升镜筒，取下载片。

2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。

五、实验报告

（一）结果   分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明放大倍数。

（二）思考题

1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？

2．显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？

       实验二   细菌的简单染色和革兰氏染色

一、目的与要求

（一）掌握染色的原理和操作过程

（二）掌握简单染色和革兰氏染色法

（三）熟练显微镜的使用技术

二、原理

由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌，

三、材料与仪器

（一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养18～24小时）、二甲苯、香柏油

（二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、镊子

（三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（12～16h），大肠杆菌。

四、操作程序

（一）简单染色法  涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检

1．涂片  取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。

2．干燥   室温自然干燥或略微加热干燥。

3．固定   涂面朝上，快速通过火焰2—3次（勿使涂片烫手）。

4．染色  放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。

6．干燥   自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。

（二）革兰氏染色法

涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色20~30秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检

1．涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。

2．干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。

3．固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。

4．初染：用草酸铵结晶紫液初染1min，水洗、吸干。

5．媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复合物）

6．脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约20～30s，立即水洗，吸干。

7．复染：用蕃红花红液复染1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。

8．镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。

（三）革兰氏染色成败的控制点

1．涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察；

2．染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判；

3．乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。

五、实验报告

（一）结果  说明3株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。

（二）思考题

1．你认为制备细菌染色标本时，应注意哪些环节？

2．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

          实验三            酵母菌形态观察

   一、目的与要求

观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。

二、原理

大小通常比细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）。

三、材料与仪器

（一）啤酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母。

（二）显微镜，载玻片、盖玻片、接种针、酒精灯。

（三）吕氏美蓝染液。

四、操作步骤

（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏染色液，以无菌操作用接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。

（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。

（三）将载玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高低倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

（四）染色约0.5小时后再进行观察，注意细胞数量是否增加。

五、实验报告

（一）结果  绘图说明你所观察到的酵母形态特征。

（二）思考题

1．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？

2．酵母水浸片制作时应注意什么？

             实验四       培养基的制备

一、目的与要求

（一）学习制备培养基的基本技术。

（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。

二、原理

牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。

三、材料与仪器

（一）试剂  牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

(二)其他  试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台称。

四、操作步骤

（一）称量  根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

（二）溶解  在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。

（三）调PH  用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。

（四）过滤  趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

（五）分装   按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装装置如实验图8所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1．液体分装   分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

2．固体分装   分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。

3．半固体分装   装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

（六）加棉塞  分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

（七）包扎  棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

（八）保存   灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。

五、实验报告

（一）结果  说明你配制培养基过程中的情况。

（二）思考题

1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？

2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？

3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？

       实验五   干热灭菌及高压蒸汽灭菌

一、目的与要求

了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

一般培养基用0.1MPa、121.1℃.

15～30min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变.

三、材料与仪器

吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。

四、操作步骤

（一）干热灭菌法  适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。

1．将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。

2．接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。

3．当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。

4．切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。

（二）高压蒸汽灭菌

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，，勿使漏气。

3．用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

4．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。

5．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。

五、实验报告

（一）结果  检杳灭菌是否彻底。

（二）思考题

1．干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？

2．为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？

3．高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？

             实验六  微生物的分离、接种和纯化

一、目的与要求

（一）掌握微生物各种接种、分离方法。

（二）掌握无菌操作的基本环节。

（三）完成一定数量的微生物接种任务。

二、原理

在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。

分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。

三、材料与仪器

（一）菌种

大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌

（二）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤半固体培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。

（三）接种环、接种针、接种钩。镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。

四、操作方法

（一）接种

1．接种前的准备工作

（1）检查接种工具。

（2）在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接咱的菌名、操作者、接种日期等。

（3）将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。

2．接种方法

（1）试管接种方法

①将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟出。

②置试管口于酒精火焰附近；

③将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。

④用接种工具取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。

⑤取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。

⑥重新塞上棉塞。

⑦烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种工具放回原处。

（2）试管菌种接到平板培养基的方法

①左手持平板和试管菌种，右手松动试管试管棉塞，烧接种工具。

②右手小指与四指取下棉塞，取菌，打开平皿。

③将菌种接种到平皿上，立即盖上平皿。

④酒精灯火焰上烧接种工具灭菌

⑤棉塞过火，重新塞上试管。

（二）分离

分离微生物的方法很多，其目的都是把混杂的微生物分离为单个细胞使其生长繁殖，形成单个菌落，以便得到纯菌种。

本实验以平板划线法分离。

1．在无菌的条件下，分别取一接种环酵母菌和青霉菌放入盛有无无菌水的试管中，制混合菌液。

2．在近火焰处，左手拿平板稍抬皿盖，右手持接种环蘸取一环混合液伸入皿内划线。

（三）培养

1．将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后观察。
    2。将接种分离后的酵母菌和霉菌放在25～28℃的恒温箱内，酵母菌培养48h，霉菌培养72h后观察。

3．平板培养基置于恒温箱内倒置培养。

五、实验报告

（一）结果

将实验结果填于下表：

                  实验表   接种情况

                  实验表   分离情况记录表

（二）思考题

1．为什么从事微生物实验工作的最基本要求是无菌操作？

2．指出你所分离的平板上单个菌落分属于哪种微生物类群，并简述它们的菌落形态特征。

3．大肠杆菌接种于葡萄糖肉汤培养基内培养24小时后，会出现什么情况？

            实验七  微生物的平板菌落计数法

一、目的与要求

掌握平板计数法来测定一定数量样品中微生物细胞数目。

二、原理

平板计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中微生物个体分散成单个细胞状态。再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于于培养皿培养基上。培养后统计菌落数目，一般认为每一个菌落是由一个细胞增殖后形成的，所以可计算出样品的含菌量。

三、仪器和材料

（一）超净工作台、恒温培养箱（36±1℃）、均质器、振荡器、吸管（1ml、10ml）、平皿、稀释瓶、天平等

（二）平板计数琼脂、75％乙醇、磷酸盐缓冲稀释液、样品、无菌水

四、操作步骤

（一）样品制备

1．以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。

2．制备样品匀液

以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。

（二）稀释样品匀液

用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml 稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。

（三）平板接种

1．对于每个样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。

2．分别用灭菌吸管吸取1ml样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。

3．分别加12～15ml平板计数琼脂（约45℃左右）到平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1ml稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。

（四）培养

待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±1℃的恒温培养箱培养48±2h。培养箱应保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％。

（五）菌落计数和记录

1．培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25～250个菌落为合适范围。如不能立即计数，应将平板存放于0～4℃，但不得超过24h。

2．操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5％之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10％这内。否则，应找出原因，加以校正。

3．计算和记录数字

适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。

记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。

五、结果

1．实验记录

报告每克（毫升）样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。

2．思考题

平板计数法的优缺点是什么

实验八    霉菌计数

    一、目的与要求

    了解霉菌计数的基本操作

    二、原理

食品受霉菌侵染后很容易引起霉变，某些霉菌的有毒代谢产物还能引起各种急性或慢性中毒，危害人类。目前已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀霉等在自然界中分布较为广泛，对食品侵染的机会也较多。所以对食品进行霉菌检测就具有重要的意义。因此，霉菌的测定的结果，可作为食品被霉菌污染程度的标志，对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

三、仪器和材料

（一）温箱（25～28℃）、振荡器、天平、玻塞三角瓶（500mL）、平皿（直径9cm）、吸管（1mL及10mL）、酒精灯等。

（二）高盐察氏培养基、灭菌蒸馏水、乙醇

四、操作步骤

1．无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。

2．用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

3．取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。

4．按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。

5．计算方法：通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌数。

五、实验报告

每克(或毫升)食品所含霉菌以个/g(个/mL)表示。

实验九   空气中微生物的检验

一、目的与要求

（一）通过实验了解一定环境空气中微生物的分布状况。

（二）学习并掌握空气中微生物检验的基本方法。

二、原理

根据空气中微生物一般吸附在尘埃中，由于地心引力尘埃下沉到地面或物体表面原理制定的。

三、材料与仪器

培养皿、生化培养箱、营养琼脂

四、实验步骤（沉降法）

1．以无菌操作将已融化并冷却至50℃的营养琼脂倒入培养皿中，放置凝固。

2．在不同地点将培养皿分别打开，在空气中暴露15分钟，立即将培养皿盖好，作上记号，并作一空白对照。

3．将培养皿放置37℃恒温培养48小时，取出观察其结果并计算出菌落数。

4．计算

计算公式：每立方米空气中细菌数＝50000N/(A×t)

N：为培养皿经培养后的菌落数

A：为所用平皿面积(cm²)，平皿直径(ø)9cm

t：为平皿暴露于空气中的时间(t=15min)

（这个公式根据：根据15min内在100 cm²面积上降落的细菌数约等于10升空气中的含菌数而估计的。）

五、实验报告

（一）实验结果

记录所得空气中的微生物的量（个/L）；

（二）思考题

比较采用过滤法和落菌法求得的每升空气中细菌含量的差异，找出原因。

             实验十   常用菌种的保藏方法

一、目的与要求

学习和掌握菌种保藏的基本原理，比较几种不同的保藏方法。

二、原理

菌种保藏是根据微生物的生理、生化特性、人为地创造低温、干燥和缺氧等条件，使微生物的代谢活动降到极低程度或处于休眠状态。从而达到使菌种在长期保存中不变异、不污染和不死亡的目的。

三、材料与仪器

（一）斜面试管、冰箱、砂土管、分样筛、真空干燥器。

（二）细菌，酵母，霉菌。

四、操作步骤

（一）斜面低温保藏法

将菌种转接在适宜的固体培养基上，待其充分生长后，用油纸将棉塞部分包扎好（斜面试管用带帽的螺旋试管为宜，这样培养基不易干，且螺旋帽不易长霉），置于4℃冰箱保藏。保藏时间依微生物的种类而异，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月移种一次，普通细菌最好每月移种一次，假单胞菌两周传代一次，酵母菌2个月传代一次。

（二）穿刺法

1．将欲保存菌种进行半固体穿刺接种，置适宜温度下培养。

2．将培养好的穿刺管盖紧，再用石蜡膜封严，置4℃放置。

3．使用时将接种环伸入生长处挑取少许细胞接入适当的培养基中，穿刺管封严后可保留以后再用。此法操作简单，是短期保藏菌种的一种有效方法。

（三）滤纸法

1．将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条装入0.6×8cm的安瓿管中，每管装1～2片，用棉花塞上后经121℃灭菌30min。

2．用无菌的脱脂奶2～3ml加入待保存的菌种斜面中，将菌苔刮下，制菌悬液。

3．用无菌滴管（或吸管）吸取菌悬液0.5～1ml，滴在安瓿管中的滤纸条上，塞上棉花。

4．将安瓿管放入真空干燥器中，用真空泵抽气至干燥。

5．用火焰将安瓿管封口（距管口约4cm）、置4℃或室温存放。

6．取用时将安瓿管破碎，取出滤纸条，用无菌水溶解干燥物，转入适当的培养基中培养。

（四）砂土管法

1．将砂土分别用10%盐酸浸泡2～4h，用水冲洗直至PH接近中性，最后一次用蒸馏水冲洗，烘干后砂子过40目筛，土过100目筛。

2．将砂与土按3：1比例混合（或其他比例）均匀后，装入10mm×100mm的小试管中，每管装1cm高，塞上棉塞，灭菌，然后烘干，抽样无菌试验，直至证明无菌后使用。

3．在欲保存的斜面菌种中注入2～3ml无菌水，用接种环轻轻将菌苔刮下，制成菌悬液。

4．每支砂土管加入0.5ml菌悬液（刚刚使砂土湿润为宜），用接种环拌匀。

5．将装有菌悬液的砂土管放入真空干燥器内（内装干燥剂）用真空泵抽干水分后火焰封口（也可用橡皮塞或棉塞封住试管口）。

6．置4度冰箱或室温干燥处保存。

五、实验报告

（一）结果

菌种保藏记录：

  实验表   菌种保藏记录

（二）思考题

1．根据你自已的实验，谈谈1～2种菌种保藏方法的利弊。

2．你认为哪些因素影响菌种的存活性？

实验十一   食品接触面的微生物检验

一、目的与要求

掌握食品接触面的微生物检验方法。

二、原理

食品接触面分为人员手、设备、器具等食品直接接触，其表面存在有微生物，为更好控制微生物生长繁殖，以大肠菌群为主要检测指标，检测结果应基本呈阴性（其中人员手需做菌落总数检测）。

三、设备与材料　

乳糖胆盐发酵培养基、EMB、乳糖复发酵培养基、大肠菌群检测纸片、无菌棉球、无菌水、酒精棉球、酒精灯、镊子　

四、实验步骤

（一）人员手检验（发酵法）

1．样品采集

被检人双手五指并拢，用一浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10ml灭菌生理盐水的采样管内。

2．细菌菌落总数的检测

将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取1ml样液，放入灭菌平皿内，倾注营养琼脂培养基，每个样品平行接种两块平皿，置36±1℃培养48小时，计数平板上细菌菌落数。

Y＝A×10（Y为工人手表面细菌菌落总数，cfu/只手；A为平板上平均细菌菌落数）

（二）大肠菌群的检测

1．乳糖发酵  每支采样管充分混匀后取1ml样液，分别放入10ml乳糖胆盐发酵管中，每个样品平行接种3管，置36±1℃培养24h。如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。

2．分离培养：将产气的发酵管用接种环分别以划线法转接于伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18～24h，取出观察菌落形态。

3．证实试验：在每个平板上，挑取可疑菌落(紫黑色或淡紫红色，有或略有或没有金属光泽的菌落)1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养24±2h进行复发酵试验，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。

（三）设备、器具等的检验（纸片法）

1．将面积为25cm²的大肠菌群检测纸片用无菌水浸湿后立即贴于被检物表面，每份检样贴2张，30s后取下，置于无菌塑料袋中。

2．将已采样的纸片置37℃培养16～18小时，观察纸片颜色变化情况。若纸片保持蓝紫色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。

五、报告

人员手菌落总数为cfu/只手，大肠菌群为未检出或检出；设备、器具等大肠菌群为未检出或检出。

    实验十二  发酵乳实验

一、目的要求

1．了解发酵乳制作常用原发酵剂菌种

2．掌握发酵乳生产的工艺流程。

二、实验器材

1．菌种：嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌。

2．器皿：高压蒸汽灭菌锅、冰箱、酸奶瓶、温度计等。

三、实验方法步骤

1．原料乳选择：选新鲜品质好的乳作原料,并不含有抗生素等药品及其他有害物质。

2．均质：均质处理可使原料乳形成均匀的组织状态。

3．杀菌：将三角瓶置蒸汽灭菌器中，加热杀菌90～95℃，10～15min。

4．添加发酵剂：将奶冷却至45℃左右，添加乳杆菌和链球菌混合发酵剂2%。

5．分装：将发酵剂与乳经搅拌混合均匀后，立即分装塑料杯中，然后用纸封口，以防止杂菌污染。

6．发酵：置于42度温箱中，培养2～3h，当pH为4.5时，即可终止发酵。

7．冷却后熟：将发酵好的酸奶，置于4℃冰箱贮藏过夜。

8．成品：酸奶呈乳白色，具有纯净的芳香酸味，凝块均匀细腻、结实。无气泡，允许表面有少量乳清析出。

四、思考题

酸奶制作的原理是什么? 

综合实训　　水中微生物的检验

     食品卫生微生物学检验主要包括食品中致病菌、细菌总数和大肠菌群的检验。由于种种原因，对致病菌的检验到目前为止还没有列入常规检验指标，而是根据不同食品选定一定的致病菌作为检验的重点。而食品中细菌总数和大肠菌群的数值则作为常用的卫生指标。

                  　　                      一、细菌菌落总数的测定

细菌总数是指水样在一定条件下培养后所得1ml水样所含菌落的总数。

（一）目的要求

1．学习采样方法和细菌总数测定的方法

     2．了解平板菌落计数的原则

     （二）基本原理

     本验采用平板计数法来测定水中细菌的总数。但由于水中细菌种类繁多，而且不同种类的微生物对营养成分和生长条件要求又各不相同，甚至差别很大，所以不可能找到一种培养基在同一条件下，使水中所有的细菌都生长繁殖。因此，以一定的培养基平板在一定条件下生长出来的菌落数来计算水中细菌总数仅仅是一个近似值。目前国家最新标准使用的培养基为营养琼脂培养基。

    （三）设备和材料

温箱（36±1℃）、冰箱（0～4℃）恒温水浴（46±1℃）、天平、电炉吸管、广口瓶或三角瓶（容量为500ml）、试管、放大镜、酒精灯、试管架。

（四）培养基和试剂

1．营养琼脂培养基

2．磷酸盐缓冲溶液

3．生理盐水

4．75%乙醇

（五）检验程序（略）

（六）操作步骤

1．水样的采取

（1）自来水  先将自来水水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再放开使水流5min后，用灭菌三角瓶接取水样以待分析。

（2）池水、河水或湖水   应取距水面10～15cm的深层水样，先将已灭菌具塞玻璃瓶瓶口向下浸没在水中，然后将瓶翻转过来，拔掉玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。

（3）其他食品的采样  无菌操作，将检样25g（ml）剪放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨作成1：10均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器以8000—10000r/min的速度处理1min，做成1：10均匀稀释液。

2．细菌总数的测定

（1）自来水

①用已灭菌的吸管吸取水样1ml，注入空的灭菌培养皿中。共做两个平皿。

②分别倒入约15ml已熔化并已冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即在桌面上作旋摇，使水样与培养基充分混匀。

③另取一灭菌培养皿，倒入营养琼脂培养基约15ml，作空白对照。

④待培养基凝固后，倒置于36±1℃温箱中，培养48±2h，然后取出进行菌落计数。

（2）池水、河水或湖水等。

①稀释水样  取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一灭菌水内，摇匀，再从第一管取1ml注入下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10^－1、10^－2、10^－3，注意每递增稀释一次，即换用1支1ml的吸管。稀释倍数依水样污染程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300之间的稀释度最为合适，若3个稀释度的菌落数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减少稀释倍数。

②从最后3个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

③各倾倒15ml已溶化并冷却到46℃左右的营养琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

④待培养基凝固后倒置于36±1℃温箱中培养48±2h，然后取出计数。

⑤同时将营养琼脂培养基倒入加有1ml稀释液的灭菌培养皿作空白对照。

（三）菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

4．菌落计数的报告

（1）平板菌落数的报告

选取菌落数在30～300之间的平板数作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2来代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

（2）稀释度的选择

应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，然后乘以稀释倍数作报告。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则看这两个稀释度所长的菌落数之比如何来决定，若比值小于或等于2，则应以两者平均数作报告，若大于2则报告其中较小的数字。若所有稀释度的平均菌落数都小于30，则应按稀释度最低的平均数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于乘  以最低稀释倍数报告之。若所有稀释倍数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均数  以稀释倍数报告之。

（3）菌落数的报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，按四舍五入计算。为了简便，常用10的指数来表示。

（七）思考题

1．从自来水的细菌总数结果看，水样是否符合饮用水标准？

2．你所测的水源污染程度如何？

                                                   二、大肠菌群的测定

大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。水中总大肠菌群数系以100ml水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示。

按国家饮用水卫生标准规定，1ml自来水中杂菌数不得超过100个，大肠菌群数1000ml水中不得超过3个才算合格。

（一）目的和要求

1．学习大=肠菌群的测定方法。

2．学会使用大肠菌群最可能数检索表。

（二）基本原理

1．乳糖发酵试验

乳糖胆盐发酵管内装有乳糖胆盐液体培养基，并在试管内倒置一杜氏管，乳糖起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群则能发酵并产酸产气，经培养后有酸产生，则培养基中的指示剂溴甲酚紫就会变色，培养基由原来的紫色变为黄色。若产气，则小倒管中有气体生成。

2．分离试验

经初步发酵试验后，并不能确定上述产酸产气的微生物为大肠菌群，需进一步证实。

伊红美蓝琼脂平板含有伊红美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖产酸产气而使环境变酸时，这两种染料即结合成复合物，使大肠菌群生成带核心的、有金属光泽的深紫色的菌落。

3．证实试验

挑取认为是大肠菌群的菌落，一方面革兰氏染色，一方面进行乳糖发酵，若既为革兰氏阴性又能发酵乳糖产酸、产气，则可确定大肠菌群的存在，即大肠菌群阳性。

（三）设备和材料

温箱（36±1℃） 冰箱（0～4℃）  天平均数 显微镜子 试管  杜氏管  吸管载玻片  酒精灯  试管架

（四）培养基与试剂

1．乳糖胆盐发酵管

注：双料乳糖胆盐发酵管是指除蒸馏水外，其他成分加倍。

2．伊红美蓝琼脂平板（EMB）

3．乳糖发酵管

4．革兰氏染色液

5．生理盐水

（五）操作步骤

1．水样的采取与稀释，同“水中细菌菌落总数测定”

2．乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ML以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置于36±1℃温箱中培养24±2h时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

3．分离试验

将产气的发酵管分别接在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

4．证实试验

在上述平板上，挑取符合下列特征的菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况，凡是乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

大肠菌群菌落特征：

①深紫色、有金属光泽

②紫黑色，不带或略带金属光泽

③淡紫色，中心颜色较深

（六）结果报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（100g）大肠菌群的最可能数（即MPN值）

                 结果记录表

（七）思考题

1．大肠菌群有何特点？

2．大肠菌群认为是被肠道病原菌污染的指示菌，为什么？

3．经检查，水样是否合乎应用水标准？污染程度如何？

                 三、实训计划

水中细菌菌落总数和大肠菌群的测定，这个实验需连续5个工作日。这两个指标的测定可以同时进行。具体安排如下：

第一天：

1．准备好整个实验所用的仪器，同时清点所需约药品。

2．清洗实验中要用到的各种玻璃器皿、量具等，并进行包扎，干热灭菌。

3．制作乳糖胆盐发酵管和伊红美蓝琼脂平板，包括培养基的制作、分装、倒平板、高压灭菌。

第二天：

1．取样、稀释、接种乳糖胆盐管，然后放入温箱培养、记录时间。

2．制普通营养琼脂培养基与乳糖发酵管，同样包括培养基的制备、分装、倒平板、高压灭菌。

3．待普通营养琼脂培养基与乳糖发酵管冷却到45度左右时，进行接种，然后放入温箱培养，记录时间。

第三天：

1．乳糖胆盐发酵管培养结束后，取出，观察产气情况，若产气则在伊红美蓝琼脂平板上划线，然后放入温箱培养，并记录时间。

2．普通营养琼脂培养基培养结束后，取出，进行菌落计数。作出细菌菌落总数的报告。

第四天：

伊红美蓝琼脂平板培养到时间后，取出，挑取可疑的特征菌落接种于乳糖发酵管。然后放入温箱培养，并记录时间。然后再挑取可疑特征菌落进行革兰氏染色。

第五天：

1．乳糖发酵管培养结束后，取出，观察产气情况，然后结合第四天革兰氏染色情况，得出结论。

2．作出被测水中大肠菌群的报告。

3．实验完毕后，递交报告，清理实验室。