实验二酶联免疫吸附试验

1.实验目的

①了解ELISA反应原理、类型及特点

②掌握直接ELISA操作步骤

③通过实验认识抗体的双重性

2.实验原理

① 抗原或抗体能物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附后的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。

②酶可与抗体通过共价键连接而形成酶标记抗体，这种结合作用并不影响抗体的免疫学活性和酶的催化活性。

③酶标抗体中的酶可催化无色底物形成有色产物，酶标抗体与相应抗原或抗体结合后，可根据有无颜色反应来判定是否有免疫反应发生，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比，因此，可以按底物显色的程度来显示试验结果。

3.实验器材及试剂

3.1器材

微量移液器，酶标仪、洗板机、96孔酶标板、PHSJ-4A型pH计等

3.2试剂

显色剂（TMB）、兔抗鸡IgG-HRP、牛血清白蛋白（BSA）、

Tween-20、标准品鸡IgG

3.3 各种缓冲液

（1）包被液（0.05 M碳酸盐缓冲液， pH 9.6）

  0.lM Na2C03  1.59 g, 0.1M NaHCO3  2.93 g, 加DDH20（DDW） 至1 L，用精密pH计调整pH值到9．6；

（2）封闭液

 3％BSA，3g BSA溶于100 mL PBS中,调整PH 7.4；

（3）洗涤及稀释液PBST和PBS(PH 7.4)

 0.01mol/L PBS缓冲液

NaCl  8.014 g， KCL  0.201 g，Na2HPO4?12H2O  3.581 g  KH2PO4   0.272g 溶于1000mL蒸馏水，调整pH至7.2，高温高压灭菌。1L PBS（pH 7.2）中加入0.5mL Tween-20配制成PBST。

（4）封闭液

称取0.1 g BSA溶于100 mL PBST中；

（5）底物Buffer

称取7.16 gNa2HPO4·12H2O溶于100 mL去离子水中，量取25.7 mL于100 mL容量瓶中；再称取2.1 gC6H8O7?H2O溶于100 mL去离子水中，量取24.3 mL于容量瓶中；再加约50 mL去离子水定容，并调pH值至5.0。

（6）TMB工作液

底物A：TMB 40mg，无水乙醇或DMSO 10 mL；

底物B： 250 μL的A溶液，加10 mL底物Buffer，临用加20 μL H2O2；

最好现用现配。 Substrate A,B液必须4℃，避光保存。

（7）终止液

2M H2SO4：浓H2SO4 20 ml，加水至180 mL；

（8）酶标抗体

兔抗鸡IgG-HRP，用PBST稀释；4℃保存30 d；

4. 操作步骤

① 抗原包被

在酶标板上包被稀释好的标准鸡IgG，每孔加100 μL，4 ℃，静置包被过夜（17 h）；

×1600(即浓度为6.25μg/mL) 

×3200（3.125μg/mL） 

×6400（1.562μg/mL）

② 洗涤

PBST洗板3次，每孔加250 μL，每次3 min；最后一次丢弃孔中溶液后在滤纸上轻轻拍打，除去孔中残留溶液；

③ 封闭

加3% BSA，每孔250 μL，37℃温育2 h；

④ 洗涤

PBST洗板3次，每孔250 μL，每次3 min，同上；

⑤ 加酶标抗体

用PBST稀释酶标抗体至最适稀释度（×500），每孔加入100μL，37℃温育1h；

⑥ 洗涤

PBST洗板3次，250μL每孔，每次3min；

⑦ 显色

每孔100μL，37℃放置30 min；

⑧ 终止反应

于各反应孔中加入2M硫酸50μL

⑨ 结果判定

可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

5. 思考题

① 封闭这一步操作为什么是必需的？ 

② 为什么说抗体具有双重性？ 

 

 

第二篇：实验十一__酶联免疫吸附测定

实验十一 酶联免疫吸附测定（ELISA ）

一、原理

酶联免疫吸附法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)是一种利用免疫学原理检测抗原或抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液—液抗原—抗体反应体系不同之处是建立了固—液抗原—抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检出1pa的目的物；同时酶反应还具有很强的特异性。除了可溶性抗原(抗体)之外，ELISA还可以检测含表面抗原的细胞。因此，ELISA是基因表达研究中不可缺少的方法。通过表达蛋白的定量测定，可以研究外源基因在转基因植株中的表达活性、外源基因在转基因植株中表达的器官组织特异性和外源基因在转基因植物中的表达调控。

ELISA检测程序包括抗体制备、抗体或抗原的包被、免疫反应及检出三个阶段，现将这三个阶段的有关原理及操作介绍如下：

（一）抗体的制备

抗体是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，以Iｇ表示。无脊椎动物不产生免疫球蛋白；两栖类产生IgM、IgG；家兔产生IgM、IgG、IgA；人类出现IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其中IgG是主要的，占总量的75％，分子量为160kDa。ELISA检测中涉及到的抗体有两种，一种是未标记的抗体，另一种是酶标记的抗体。酶标记的抗体又有两种情况，第一种是针对特异抗原的酶标一抗，第二种是针对一抗的酶标二抗。酶标抗体制备包括通过免疫过程制备抗体及对所获的抗体进行酶标记两大步骤。

1．通过免疫反应制备抗体

1)抗原制剂的制备 要获得优质抗体，使用的抗原必须具有较强的免疫原性并应经过纯化。完全抗原具免疫原性(刺激机体产生一系列免疫反应)及反应原性(与抗体发生特异性反应)。如果只有反应原性而缺少免疫原性或免疫原性不完善，则称不完全抗原或半抗原。需要用半抗原进行免疫反应时，应将半抗原与一些免疫原性强的蛋白质，如BSA、γ—球蛋白等(这些蛋白质称为载体蛋白)进行化学偶联，或通过戊二醛作用使二者交联形成多聚体，这样均可提高其免疫原性。免疫时，需将抗原制备成抗原制剂。制备抗原制剂常使用免疫佐剂。可溶性抗原经佐剂乳化后注射，佐剂—抗原的乳化物在动物机体内逐步释放，可延长抗原在机体内的存留时间，便于抗原在较长时间里不间断地刺激机体免疫系统，提高抗体效价。另外佐剂中含有激活巨噬细胞等生理活性的卡介苗类物质，可提高抗原的免疫原性。常用的佐剂是福氏佐剂，成分是1份羊毛脂+5份石腊油混合后加入3-4 mg／m1的卡介苗，此为完全福氏佐剂，不加入卡介苗的为不完全福氏佐剂。

2)免疫反应 抗体是通过免疫反应产生的。免疫反应是机体在抗原刺激下产生的体液免疫(体液抗体)和细胞免疫(效应淋巴细胞)的过程。这一过程依赖于抗原的特定的化学结构(抗原决定簇)及动物机体的免疫反应能力(抗原免疫原性)。动物机体免疫反应能力除受遗传因素控制外，还与机体的生理状态、抗原进入机体的途径、佐剂的使用等因素有关，因此制备抗体时这些因素都应在考虑之内。同一抗原对不同种动物、同种但不同品系的动物、甚至不同的个体，产生特异免疫反应的强弱都可能不同。因此，必须选择对该抗原敏感的动物进行免疫。最常用的动物是家兔，此外还有山羊、鼠、鸡、马等。

抗体的产生需要一个过程。第一次免疫时产生抗体的水平低，并不持久，其主要成分是IgM，需进行再次免疫。当抗原第二次进入体内时，体内的抗体迅速与抗原结合，因而在开始时体内抗体水平下降，一两天后抗体水平又显著上升，并在短时内达到高峰。该高峰水平

高于第一次免疫，此抗体水平可维持数月，其主要成分是IgG。如再注射一次，抗体水平可再提高，直到不能再继续增高为止。此做法称为加强免疫。注意，要获得最大的免疫反应，第一次和第二次抗原注射之间的时间间隔不能太短，一般在3～6周。

免疫途径有耳静脉、淋巴结、肌肉、皮下、皮内等注射。最简单而且也是最常用的是多点注射：将抗原—佐剂的混合液注射到动物皮内或皮下的多个位点内，其优点是第一次免疫反应快，抗体效价高，需要加强免疫的次数少。

3)抗血清制备 抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清。在加强免疫7～10d后可从耳缘静脉或直接穿刺心脏取血，静置，离心，上层血清即为抗血清。由于抗原与抗体反应具有高度的特异性，因而有时抗血清往往可不经纯化，直接用于检测。

4)抗体的纯化 抗体有5大类。抗体纯化有两个含义：一种是指抗体类别的纯化，如从抗血清中纯化出IgG类；另一种是指从该类中除去与相应抗原无关的抗体成分。制备酶标抗体时，往往需要从抗血清中纯化出IgG，IgG在免疫球蛋白中约占75％一80％。从抗血清中制备IgG第一步多采用50％饱和度的硫酸铵盐析，沉淀出丁—球蛋白(主要成分是IgG)，经透析或用SephadexG50凝胶柱层析去盐后得粗提的丫—球蛋白溶液，然后再进行纯化。纯化的方法有多种，可用DEAE—纤维素DE—52柱层析，用0.01 mol／L(pH 7.4)磷酸缓冲液洗出第一蛋白峰后，缓冲液中加入0.05 mol／LNaCl，洗脱第二峰，这两峰为IgG的不同亚类。此外还可以用蛋白A吸附，蛋白A能与IgG重链的Fc段第二和第三稳定区结合。蛋白A和IgG形成的多分子复合物在低pH条件下解体，利用这一性质可在高pH条件下使二者结合，上柱，然后降低pH，洗脱IgG。从IgG中纯化某种特异抗体主要是通过与相应抗原特异地沉淀或特异地亲和吸附来完成。

2．抗体的标记

所谓酶标记是使抗体与酶交联。常用的抗体标记方法有荧光素标记、生物素标记和酶标记三种。

目前抗体标记常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AKP)。使辣根过氧化物酶交联在抗体上的方法主要有戊二醛法及过碘酸氧化法。戊二醛交联法又有一步法及二步法。一步法是将一定量的酶、抗体和戊二醛同时加入溶液，在一定温度下反应一段时间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶标抗体。一步法的产率只有6％一7％，这是因为交联反应主要是靠蛋白质分子中的赖氨酸残基，辣根过氧化物酶分子中300多个氨基酸残基中只有6个赖氨酸残基，出售的辣根过氧化物酶试剂中只有1—2个赖氨酸残基可供交联，而抗体分子中可供交联的赖氨酸残基很多，因而反应中极易形成抗体的聚合物而酶与抗体交联相对就很少。为解决这一问题，改用二步法，即先将戊二醛与酶反应，透析除去未结合的戊二醛，再加入抗体，这样就不会出现抗体自聚问题（在正常的情况下，HRP只与一个戊二醛分子的一个醛基反应，第二个醛基不与同一个或其他酶分子反应）。二步法的标记效率为10％～15％。反应后未结合的抗体及多聚抗体都要用凝胶过滤方法去除，否则干扰检测。过碘酸法利用HRP是一种糖蛋白的特点，过碘酸将糖中的羟基氧化成醛基再与抗体直接连接，然后再通过加入硼氢化钠还原成稳定的酶结合物。该法效果比戊二醛法好。

荧光色素是最常用于标记抗体的标记物之一。荧光素经特定波长的光激发可发射出特定波长的荧光，从而得知抗体的定位、多少和待测抗原的分布情况。生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，利用抗体-生物素-亲和素-酶/荧光标记的特异结合可以对生物素标记抗体进行免疫分析。

表5-1各种标记方法的比较

标记方法

荧光色素

生物素 直接法<或间接法 直接法或间接法 直接法或间接法 检测方法 荧光显微镜检 与各种标记物偶联的

亲和素或链霉亲和素 优 点 保存时间长分辨力好保存时间长敏感性高通用检测手段

多种检测方法

酶 间接法 色原底物显色 保存时间长敏感性高

肉眼可见结果 多步骤， 内源性酶干扰低分辨力 缺 点 自发荧光 多步骤，内源性生物素干扰

（二）包被

ELISA检测的第二个重要环节是包被，即将抗原或抗体固定在固相载体表面，亦称包埋。包被可采用物理吸附或共价交联的方法，包被好坏是影响固—液抗体—抗原反应的重要因素之一。

ELISA中最常用的固相载体是多孔的聚苯乙烯微量反应板。除聚苯乙烯外，可用作固相载体的物质还很多，如纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。聚苯乙烯微量反应板所用的样品量少，使用较方便，敏感性和重复性也较好，目前已有市售。另外还有硝酸纤维素滤膜及Sepharose 4B(使用时需经溴化氢活化)等，如果要固定含抗原的细胞，则可用载体玻片。聚苯乙烯微量反应板对蛋白质有较强的物理吸附作用，与蛋白类抗原(体)结合较强，当被检物为半抗原时，需将半抗原与血清白蛋白等蛋白质载体结合，以半抗原—载体结合物的形式包被，但以蛋白质作载体时易发生交叉反应，有报道用尼龙6做载体，尼龙6与抗原形成的结合物在室温条件下放置比较稳定，用苯酚—乙醇溶解后即可包被在微孔板上。使用聚苯乙烯反应板时，应用低离子强度并偏碱性的包被缓冲液，因在此条件下，蛋白质易被吸附，缓冲液pH值在6.0以下时，非特异性的吸附会有所增加。包被物质必须是可溶性的，浓度一般在1～100Ps／m1左右，最适的包被浓度需预先通过棋盘滴定来确定。做法是在滴定盘上，用不同浓度的包被物质(可用梯度稀释的方法制备)与一定稀释度的抗体一起温育，然后比色测定，选择阳性孔光吸收值大于或等于1.0，阴性孔吸收值小于0.2的稀释倍数作为抗原包被液的使用浓度。包被的时间与温度一般采用37℃、2～3h或4℃过夜。为减少非特异性吸附，包被后需进行洗涤，洗涤液中含有0.5％的牛血清白蛋白或0.1％的白明胶，并加入约0.05％的Tween-20。

（三）封闭

封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA，酶联免疫试剂盒其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。

封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法只要酶标记物是高活性的、操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中封闭一般是不可少的。

（四）免疫反应

ELISA检测的最后一环是抗原与抗体结合的免疫反应。具体测定方法有多种，但无论是测定抗原还是抗体，都必须选择好抗原、抗体、酶标抗体三者的浓度关系，为减少误差，定量测定时光吸收值原则上要大于1.0，需根据抗原或抗体的不同要求，用棋盘法加以确定。 ELISA检测可溶性抗原主要有两种方法：一是将抗体包被在固相载体上，抗原从样品中俘获，也就是样品中的特异抗原与包被在载体上的抗体结合，形成抗体—抗原复合物，从而被固定下来，再加入酶标记的抗体(酶标一抗，形成抗体—抗原—酶标抗体复合物)，或先加入非酶标记的抗体，形成抗体—抗原—抗体复合物后再加入酶标记的抗抗体(二抗)，这样酶便被固定在有抗原结合的固相载体的表面。洗涤除去未结合的酶标抗体，加入该酶的显色或荧光底物，通过酶促反应所发生的颜色或荧光变化可测定出抗原的量，此方法称为夹心法。二是将样品中的抗原包被在固相载体上(样品中无抗原则不发生包被)，然后令一抗与抗原结合，使一抗被固定，再加入与一抗特异结合的酶标二抗，从而使酶固定在有抗原的位置上。通过酶的显色或荧光反应测定抗原的量，这称为间接法。除了这两种方法外，还有其他的方法，如竞争法等。总之，在ELISA检测过程中酶反应只在最后进行一次，而抗原抗体的免疫反应可使用二抗或三抗多次进行，应根据需要自行设计。

（五）、检出

ELISA最后是通过酶反应检出，目前最常用的酶—底物系统是辣根过氧化物酶(HRP)系统和碱性磷酸酶(AKP)系统。 表5-2 ELISA检测的酶—底物系统

酶

辣根过氧化物酶 底 物 3，3—二氨基联苯胺

5—氨基水杨酸

邻苯二胺

邻联甲苯胺

碱性磷酸酶 4—6目基酚磷酸

萘酚—As-Mx磷酸盐+重氮盐

（六）检测中应注意的问题

ELISA用于定量分析时，微孔板上同时设有标准样品及待测样品。尤其要说明的是测试结果的准确性与样品的重复数及样品在板上的配置有关。增大样品重复数可提高测定的准确度。所以，测定时同种样品一般二孔以上，并根据实验误差要求选择最佳配置。另外需要注意的是实验空白值的合理性及作为二抗的抗体—酶的用量是否合适。ELISA的灵敏度与实验操做程序有关。在不增加设备的条件下，可以改变传统的操做程序(一抗，二抗分两步先后与固相结合)来提高灵敏度。Naser等介绍，利用抗体和抗抗体(二抗)能成多层复合物的特性，将抗体与抗抗体—酶预先混合温育好，一步加入到包被好抗原的微孔板中，经保温洗涤后即行测定，该做法可使检测水平提高10-20倍。此外，通过酶放大系统来提高灵敏度也已采用。Bobrow等利用与抗体偶联酶的一级反应引发包被在微孔板上的二级反应系统，达到放大作用。此外还有Lejeune等的酶1—抗体—抗原—酶2的二种酶的级联放大系统。 ELISA检测很灵敏，但易出现本底过高的问题。产生本底的原因大致有三方面：①物质与固相载体的非特异性的结合，为减少这种原因造成的本底，无论是包被、免疫反应，还是酶促反应，每次反应之后都要反复洗涤，洗涤缓冲液中加入适量的表面活性剂如Tween-20和BSA。表面活性剂促进洗去过量物质，BSA与固相载体表面结合封闭非特异性位点。另外，正确地洗涤也很重要，使用微量反应板时，易形成气泡或水滴附着，倾倒板不能除去，要用力甩干。洗涤时，缓冲液浸泡时间长些，洗涤效果好，可采用3～5 分钟，第一次用5 分／产物颜色 深褐色 测定波长(nm) 沉淀 棕色桔红色，460 蓝色黄色红色

钟，以后可用3 分钟。②植物细胞的内源性的酶，尤其是过氧化物酶在植物细胞中含量较高，当样品被吸附到板上时，样品中的内源性酶与抗体上偶联的酶一样，能催化显色反应，因而产生本底。解决的方法是在提取液和包被液中加入叠氮化钠，可使样品中的过氧化物酶完全失活，然后彻底洗去叠氮化钠。③使用的抗原或抗体不纯，特异性下降，非特异性反应使本底升高。

ELISA目前存在的问题之一是缺乏标准化，使用同一方法，若在操作方法上出现的某些差异，如保温时间的长短，洗涤方法不同等都会引起实验效果的不同。目前，测定可溶性抗原的第二种方法已有标准化的酶标二抗试剂出售。另外还有一些公司出售针对专一抗原的试剂盒，如美国Prime公司有npt—ⅡELISA试剂盒。

二、材料、仪器和试剂

1．材料：转烟草花叶病毒基因的烟草和非转基因的烟草。

2．仪器：

酶联免疫检测仪。酶标板选用天津有机玻璃厂生产的96或48孔聚苯乙烯板，在95%乙醇中浸泡2小时，用蒸馏水冲洗两遍，凉干备用。

3．试剂

除2mg/m1 BSA、0.15 mol/L NaCl、一抗、Tween-20、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、邻苯二胺(OPD)外，其他试剂如下：

①. 提取缓冲液：50mmol／LTris·C1，0.029％NaN3(pH9.5)。

②. 包被缓冲液：1.6 g Na2CO3，2.93 g NaHCO3，0.2 g NaN3，dH2O定容1 000 ml ③. 磷酸贮备液(50 X)：145 g Na2HP04·12H20，7.8 g NaH2P04，dH2O定容

1000ml(pH7.4)

④. PBST洗涤液：100 ml磷酸贮备液(50X)，1 mlTween-20，14.61 gNaCl，dH2O

定容至1 000ml(pH7.4)

⑤. 血清稀释液：100m1磷酸贮备液(50X)，1 mlTween-20，8.77gNaCl，dH2O定

容1000ml(pH7.4)

⑥. 底物缓冲液：0.4667 g柠檬酸，1.8427 g Na2HP04·12H20，dH20定容50 m1(pH5.8) ⑦. 底物反应液：10mg邻苯二胺，37?l 30％H2O2，25m1底物缓冲液(pH5.0)，现

用现配。

⑧. 封闭液：0.1 gBSA，10ml包被液(pH9.5)

⑨. 终止液（2 mol/l H2SO4）： 96%浓硫酸11.2 mL，加水至100 mL。

三、操作步骤：

1．

2．（包被缓冲液）和阴性对照。37℃保温2小时后，将孔中的样品溶液甩掉。每孔加入150?L包被缓冲液，室温放置3分钟后甩去、控干，重复洗涤三次。洗完后将板甩净，放在滤纸上以除去残余缓冲液和气泡。

3．封闭：每孔加100μl封闭液，37℃保温2小时，用PBST洗板三次，每次3分钟，（200?l、100?l 、100?l）。

4．加一抗：每孔加200μl，37℃保温1.5小时，每孔加入150?l包被液，室温放置3分钟

后甩去、控干。重复洗涤三次。

5．加二抗：用血清稀释液将辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG稀释成效价5：1，每孔加100?l稀释二抗，370C保温1小时，洗板同4。

6．免疫反应：每孔加100μl底物反应液，370C黑暗中反应20分钟或适当控制时间。

7．终止反应：每孔加100μl 终止液，终止反应。

8．测定：在酶联免疫检测仪上测OD492，以OD处理值/ OD对照值大于2为阳性判断标准。