人乳头状瘤病毒呈阳性

很多人患了人乳头状瘤病毒，检验出来是阳性，这对于身体的危害是极大的，不过对于人乳头状瘤病毒阳性的了解很多人还是很模糊，人乳头状瘤病毒阳性是指人体内感染了某一种亚型HPV。而hpv阳性疾病初期所表现的症状就是尖锐湿疣的临床损害。

人乳头状瘤病毒呈阳性对人体的危害：

病毒分析已经发现100种类型的人乳头状瘤病。发现其中6型和11型危险性低，发育异常也很少;而16、18、31、33、35、45型则具有高危险性，常可引起发育异常。而绝大多数肛门人乳头状瘤病毒感染都是6型和11型。

人乳头状瘤病毒至少引起人类10余种疾病。常见的为寻常疣，学龄儿童的发病率高达50%。它还可引起多种性传播疾病，其中最主要的为尖锐湿疣。而引起手、足部位 “寻常疣”的HPV与在生殖器和肛门区域引起疣的HPV是不同。某些类型的人乳头状瘤病毒还与生殖道恶性病变的发生有关，如子宫颈癌、肛门癌、阴道癌和阴茎癌。但在生殖器或肛门周围能引起外生型疣的人乳头状瘤病毒类型并不会引起癌症。

人乳头状瘤病毒是如何传播的?

人乳头状瘤的患者和携带者是主要的传染源。在美国，人乳头状瘤病毒感染是最常见的性传播疾病之一。它的感染性很强，最常由性接触传播，它可以在疣未产生前或未出现明显症状的情况下就传染给他人。另外，密切接触、皮肤擦伤、婴儿通过感染的产道、自身接种(通过抓搔传染到身体的其它部位)和污染物传播也是比较常见的传播途径。

如何使人乳头状瘤病毒阳性转阴?

人乳头状瘤病毒的危害是极大的，所以患者必须选择一种一劳永逸的疗法彻底根治人乳头状瘤病毒，著名性病医师赵青山推荐当下最受推崇的双向免疫生物抗体激活疗法，该疗法的的疗效迅速，作用彻底，上万例患者康复证实，临床有效率达到95%以上，康复后跟踪，观察，不复发、不反弹99%。

双向免疫生物抗体激活疗法治疗人乳头状瘤病毒的优势：

1、靶向性:精确识别体内尖锐湿疣病毒及病毒感染细胞，对人体正常细胞及其它机体组织无任何影响。

2、主动性:通过大量特异性抗病毒抗体，对尖锐湿疣病毒主动进行精确强效地捕杀，使病毒失去感染能力。

3、高效性:可一次直接产生大量高效的特异性抗病毒抗体，迅速彻底清除尖锐湿疣病毒，修复受损细胞。

4、安全性:利用自身感染组织提取和形成，与患者本人DNA完全一致，避免了排异反

应，保证治疗过程无任何副作用。

5、长久性:大量特异性抗病毒抗体及成熟的免疫细胞在体内永久存活，为防止复发或再感染提供了长期保护。

6、防复发:彻底消除残留病毒，有效调节人体免疫功能，增强抗病毒及防复发能力，抵御病毒再次入侵。

 

第二篇：人乳头瘤病毒16型假病毒中和实验的建立和初步应用

!!卷"期

!##"年$$月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12%&’(!!)&(")&*+,-+.!##"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!人乳头瘤病毒!"型假病毒中和实验的建立和初步应用

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卢五迅，程通，李少伟，潘晖榕，沈文通，陈毅歆，张涛，郑舟，张军"，夏宁邵"

UPV8JW89，MXN)Y:&9A，UZC;?&JV+1，D3)X81J/&9A，CXN)V+9J:&9A，MXN)H1JW19，IX3)Y:?&，IXN)YI;&8，IX3)Y789"?92WZ3)19AJC;?&"

国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门大学生命科学学院，厦门L"$##R

3+/#($+,4$&/#/)/%(-5#+1$(&/#0&+$67+00#$%5%8%,(9:%$/#$4$-%0/#()&5#&%+&%&，;0"((,(-<#-%;0#%$0%&，=#+:%$>$#8%*&#/2，=#+:%$L"$##R，!"#$+摘要探讨了应用多质粒磷酸钙共转染方法在!5LF:细胞中生产XD%$"（;8,?94?41’’&,?*1.8<6@4+$"）假病毒。蛋白印迹检

通过透射电镜可观察到形态与天然病毒粒子相似的假病毒颗测显示在转染后细胞的裂解上清中具有很好的U$蛋白活性，

粒。对!5LF:细胞的感染实验显示，该假病毒可有效将NYFD报告质粒导入靶细胞中进行表达，经测定其滴度约为![$#\:P],U。通过与G株XD%$"对照单抗的中和实验证明该假病毒可有效应用于中和实验。应用该方法从$Q株抗XD%$"U$的单

低成本和易于克隆抗体中鉴定获得了!株中和单抗L^$#、D^$。所建立的XD%$"假病毒生产和中和实验方法具有快速高效、

检测的优点，适于进行较大规模应用，为快速准确鉴定XD%$"中和单抗和候选疫苗的免疫保护效果提供了有效手段。关键词人乳头瘤病毒，假病毒，中和单抗

_Q$L文献标识码3文章编号$###JL#"$（!##"）#"J#55#J#"中图分类号

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A.?21+9621’861&9&B6;+=+’’12+961B1+2,3-<%R，N\#，PG?92^5?926;+98<+26&19B+06!5LF:0+’’<4.+4’?6+2195"J=+’’61<<8+08’68.+4’?6+(:;+19B+061&9&B4<+82&*1.1&9<0&8’2-+19;1-16+2-@9+86.?’1S19A,3-<%R，N\#?92PG6;?6.+0&A91S+<8.B?0+0&9B&.,?61&9?’+416&4+<&9U$%UD，-869&6-@,3-^56;?61<.+?061*+6&?’19+?.+416&4+-8.1+219%UD，=;10;19210?6+26;?66;+4<+82&*1.1&9<0&8’2-+8<+26&+*?’8?6+6;+9+86.?’1S?61&9+BB101+90@&B,&9&J?924&’@0’&9?’?961-&21+<(:;+4<+82&*1.1&9<=+.+6;+9+,4’&@+26&12+961B@9+86.?’1S19A,3-<B.&,$Q,3-<A+9+.?6+24.+*1&8<’@19&8.’?-，Q&B=;10;=+.+0&9B&.,?61&9?’?92$#=+.+’19+?.(D^$?92L^$#，-&6;&B=;10;.+0&A91S+20&9B&.,?61&9?’+416&4+<&9U$%UD，;?2&-*1&8<’@<6.&9A

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/+0+1*+2：34.1’!5，!##"；300+46+2：789+"，!##"(

（)&(!##GHI#$J$K!##LH#G$）?926;+D.&A.?,B&.)+=:;1<=&.>=?<<844&.6+2-@6;+A.?96<B.&,6;+C01+90+?92:+0;9&’&A@D.&E+06<&BF8E1?9D.&*190+

，M;19?(M+968.@NO0+’’+96:?’+96<19P91*+.<16@（)MN:）

"M&..+<4&9219A?86;&.(:+’：Q"JR5!J!$QG$$L；F?O：Q"JR5!J!$Q$!RQ；NJ,?1’：S;?9AETO,8(+28(09

福建省科技重点项目（)&(!##LH#G$），福建省科技重大专项（)&(!##GHI#$J$），教育部跨世纪优秀人才培养计划。

卢五迅等：人乳头瘤病毒;A型假病毒中和实验的建立和初步应用

LL;

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,#0&!B&B(’’50&4(%#3，B3"#/54(%(5!，!"#$%&’()(!*05!5-’5!&’&!$(25/6

人乳头瘤病毒（?9@）为无包膜的环状双链:C1病毒，基因组大小约D>2，包裹于由主要衣壳蛋白E;和次要衣壳蛋白EF组成的病毒衣壳内。超过G=H

［;］的宫颈癌与?9@;A感染相关，?9@;A疫苗的研制

)*+磷酸钙共转染构建,-.)/假病毒

将FL<M8细胞预先铺于;=-0细胞培养皿（KX

，;=AY/(3,）G,后将质粒B;AE;,、B;AEF,和BC<;OPQM9用磷酸钙方法进行共转染，用量均为I=*。磷酸钙转!

染方法：提前G,将FL<M8细胞预铺至FI孔细胞培养板（;ZGX;=GY+"’’）或;=-0细胞培养皿（KX;=AY/(3,），

加将=ZG05’YE的R&R’F溶液与等体积的//?FW混合，（B?[入适量质粒，再缓慢加入F倍体积的FX?"JN溶液中并吹泡混合均匀，静置G0(!后将混合液AZLK）

加至预铺的FL<M8细胞孔中，;F,后更换为完全培养基。同时对同样数量的细胞转染I=*的BC<;OPQM9!

作为对照。ID,后进行观察并收集和裂解细胞，将收集的细胞裂解上清置\D=]保存。)*0

脂质体123%4"567829"+:::转染哺乳动物细胞提前G,将FL<M8细胞预铺至FI孔细胞培养板（;ZGX;=GY+"’’）。取;*BC<;OPQM9转染到预铺的!

细胞中，脂质体E(B5."-$&0(!"F===转染方法见S!4($%5*"!公司操作手册。;F,后更换为完全培养基，ID,后进行观察和检测。)*;

（<"(6"&9=>%6629?）,-.)/1)的蛋白印迹实验

取少量细胞裂解上清样品进行;=HN:NO91QP

是宫颈癌预防的最根本措施。目前对?9@疫苗免疫抗体的保护效果的评估方法主要有免疫缺陷小鼠

［F］［<］

组织移植、体外感染原代上皮组织以及类病毒［I］颗粒（@E9）血凝抑制实验等，但这些方法均存在

操作复杂、效率低、实验周期长或不能直接反映抗体的中和保护作用等问题。研究显示利用?9@@E9可非特异性包裹质粒核酸的特点构建?9@假病毒

［G，A］

是体外模拟?9@感染过程的有效方法。最近

［］

J#->等K提出了将密码子优化的?9@结构蛋白表

达质粒和报告质粒共转染FL<88细胞可高效获得包装报告质粒的?9@假病毒，该方法相比其它应用重

［G，D］［A，L］

组病毒表达载体和化学偶联等生产假病毒的方法具有简便、效率高的优点，有很好的应用潜力。然而，该方法用脂质体进行质粒转染，在大量用于疫苗质控时成本高昂。为解决这一问题，本研究采用效率和经济更优的磷酸钙转染方法，并以获得了高滴度的FL<M8细胞为假病毒生产平台，

可有效应用于抗体的中和实验。该?9@;A假病毒，

方法具有效率高、成本低和操作简便的优点，适合于进行较大规模的生产和应用，为?9@;A预防疫苗的

研究开发提供了有利的条件。

电泳后转移到硝酸纤维膜，按文献［;;］方法进行蛋白印迹实验。使用的一抗为?9@;AE;单克隆抗体

二抗为辣根过氧化物酶（?V9）标记的羊抗鼠:L，S*Q。)*@

A%6=>%6629?鉴定单抗识别表位的构象依赖性将原核表达的?9@;AE;@E9样品（由北京万泰

)

)*)

材料和方法

质粒、细胞及单克隆抗体

质粒B;AE;,和B;AEF,由N-,(’’"%教授惠赠，分

别含有经密码子优化后的?9@;AE;和EF表达元

［K］［;=］

。报告质粒BC<;OPQM9为本实验室构建。件

以上三种质粒均按照文献［;;］方法进行R3R’密度梯度超速离心纯化。细胞株FL<M8购自S!4($%5*"!

公司提供）和经煮沸变性解聚后的@E9样品

，分别进行;=倍梯度稀释后点样到硝酸（=Z<*Y!E）!纤维膜上，用GH脱脂奶封闭后与不同的单抗分别

进行反应，显色方法参照蛋白印迹实验。与@E9反应性好而与@E9煮沸后的样品反应性差的单抗的识别表位应与特定的空间构象有关；与@E9煮沸后的样品好的单抗的识别表位应不受空间结构的影响，属于线性表位。)*/

假病毒颗粒的纯化和透射电镜观察

（J"->0&!）中加L0E的<=H在C@8AG离心管

剩余的离心WB$(9%"B和;Z=0E收集的细胞裂解液，

公司，培养于含;=HMJN的:TPT完全培养基中。

?9@;A单克隆抗体@G、UI、PK=和:L由R,%(3$"!3"!

［;F］博士惠赠。蛋白分子量0&%>"%购自9SPVRP公司，WB$(9%"B购自N(*0&公司。

>>$

#$%&’(’)*+,&-.*/0%*1’2$&*.*34生物工程学报$%%"，.GDA$$，-GA"

管空隙用离心介质补充，!"#下"$%%%&’()*离心+,

（-./"+转头，。取出，用针头0123(4*超速离心机）以蛋穿刺离心管底部收集离心组分，每份约$+%5，!

白印迹实验方法检测各组分中的5!蛋白活性。取活性最高的组分上样到铜网，用$6的磷钨酸染色

用789$!%%透射电镜（日本电子公司）观察颗!+()*，粒。!"#

感染滴度测定

收集获得的细胞裂解液用!%6:989进行!%倍梯度稀释（!%;$<!%;"），分别取!%%5稀释液感!染铺于$=孔细胞培养板中的$>?@/细胞（!A+B!%+’，对照细胞裂解液也做同样的稀释感染。培养C1DD）

（0123(4*FGHDI1&8JKFLM5）检=E,后用流式细胞仪

测孔中表达8N@J的细胞数量，测定假病毒的滴度

。（/O’(5）!"$

抗体滴度的测定

每PJ.!"5!.5J以浓度=Q’(5包被85KLR板，!

孔加样!%%5，=#过夜后再?S#包被$,。吸弃液!体，用封闭液?S#封闭$,，扣干后备用。将!%%5!经稀释后的待检样品加入上述预包被孔中，?S#孵育=+()*，扣干；分别加入!%%J0L/洗涤+次，5稀!释好的羊抗鼠KQNTPUJ，?S#孵育=+()*，J0L/洗涤扣干；在各反应孔中依次加入+%+次，5显色液R、!

在0，?S#显色!%()*后加入+%5终止液终止反应，!酶标仪上读!"=+%’"$%*(值。抗体滴度的定义为：读值高于FHIGVV值以上的抗体最大稀释倍数。

!"%绿色荧光的观察

表达绿色荧光蛋白的细胞置于-)3G*/8$%%%倒置荧光显微镜下采用蓝光激发观察，用-)3G*:M9!$%%@FF:采集荧光图像。!"!&假病毒中和实验

将$>?@/细胞铺于>"孔细胞培养板中（!A+B。+,后进行中和实验，将不同样品分别用!%=’C1DD）

然后取!%6:989从!%倍起进行连续倍比稀释，+%5分别与+%5稀释于!%6:989的假病毒液!!（(G)W%A!）混合。=#孵育!,后分别加入预铺有$>?@/细胞的>"孔细胞培养板中，?S#培养=E,后用流式细胞仪分别检测各孔细胞的感染率。感染率为细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。感染抑（!;阻断孔的感染率’未阻断孔的感染率）制率WB!%%6。$%倍稀释后能达到+%6以上感染抑制率的

［!?］

。单抗为中和单抗

’

’"!

结果和分析

()*!+假病毒的获得

对磷酸钙方法共转染X!"5!,和X!"5$,和X-?!T8N@J后收获的$>?@/细胞裂解上清进行蛋白

印迹实验。检测结果显示，细胞裂解上清中可检测到较强的PJ.!"5!蛋白的表达活性，分子量约为

（图!）。应用?%6的YXI)J&1X对细++3:与预期相符

胞裂解液进行了超速离心，以蛋白印迹实验方法检测系列样品中的5!蛋白活性，结果显示活性主要集中于第!$号组分。对该组分进行透射电镜观察，可观察到大量的PJ.!"假病毒颗粒（图$），其直径约

为++*(，形态结构与文献报道的PJ.!"天然病毒颗

［!=］

粒结构基本一致。

图!转染后$>?@/细胞裂解液中PJ.!"5!蛋白

的Z1[I1&*\DGI检测

Z1[I1&*\DGII)*Q4*4D^[)[GVPJ.!"5!)*

D^[4I1[GV$>?@/21DD[

@)Q]!

!：X&GI1)*(GD12HD4&C1)Q,I(4&31&；$：I&4*[V12I1_C)I,X-?!T8N@J；?：2GI&4*[V12I1_C)I,X!"5!,，X!"5$,4*_

X-?!T8N@J]

图$@)Q]$

PJ.!"假病毒颗粒的透射电镜观察8D12I&G*()2&GQ&4X,GVPJ.!"X[1H_G‘)&)G*[

’"’磷酸钙与脂质体方法对’%,-.细胞转染效率的对比

本实验室已对磷酸钙转染$>?@/细胞的方法进

卢五迅等：人乳头瘤病毒&J型假病毒中和实验的建立和初步应用

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行了优化改进，为比较改进后的磷酸钙方法与脂质体方法对!"#$%细胞的转染效率，我们分别通过磷酸钙和脂质体将&’()的报告质粒*+#&,-.$/转染!

入铺于!0孔板中的!"#$%细胞（&’12&(134566），转染后078后用流式细胞仪检测报告基因转移效率和应用改阳性细胞平均荧光强度。结果如表&所示，进的磷酸钙方法对!"#$%细胞可以达到很好的转染效果（9:&#’!1，，且其使用成本远低于脂!;(’(&）质体方法，因此本研究将采用磷酸钙多质粒共转染方法生产假病毒。

表!磷酸钙与脂质体方法对"#$%&细胞转染效率的对比&’()*!+,-.’/01,2,34/’213*540,2*33050*250*102"#$%&

5*))1(65’)507-.8,1.8’4*’29:0.,3*54’-02*";;;

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!J!’0&1J’L

孵育078后观察并检测细胞中-.$/的表达情况。结果显示，N/O&J假病毒可有效将-.$/表达质粒导入!"#$%细胞中进行表达，而以同样方式单独转染*+#&,-.$/后获得的细胞裂解液不能使靶细胞表达-.$/（图#）。在!"#$%细胞中对N/O&J假病毒的感染滴度进行测定的结果显示其滴度约为!2&(L%P3HK。"<A

=>?!@假病毒中和实验的建立

应用0株已证实的N/O&J单克隆抗体对本研

究获得的N/O&J假病毒进行中和实验。这0株单抗中，具有中O1、P0、-L(已被证明均识别构象表位，和能力；不具有Q"识别包埋于N/O&J内部的表位，

［&!，&1］

中和能力。其中O1识别的表位被认为是

［&J］

具有较强的中和能力。N/O&J的优势中和表位，

对照单抗的对假病毒感染的阻断结果如表!所示，N/O&J假病毒对!"#$%细胞的感染可被单抗O1、

而不会被Q"所阻断，其中O1具有P0、-L(所阻断，

较高的中和滴度。该结果证明本研究获得的N/O&J假病毒可有效应用于中和实验。

"<$

=>?!@假病毒对细胞的感染及滴度测定实验将获得的细胞裂解液取&K在!0孔细胞培养!

板中对!"#$%细胞（!2&(134566）进行感染实验，#LM

图#N/O&J假病毒对!"#$%细胞的感染实验

$C)R#!"#$%A566?C>@5AB5S4CB8N/O&J*?59SDTC<CD>?

U：C>A9V=B5S4CB86E?=B5?D@!"#$%A566?ADB<=>?@5AB5S4CB8*&JK&8，*&JK!8=>S*+#&,-.$/；W：C>A9V=B5S4CB86E?=B5?D@!"#$%A566?B<=>?@5AB5S4CB8*+#&,-.$/R

表"=>?!@对照单抗对假病毒感染的阻断

&’()*"!"#$%&’2*74/’)0B’40,2,3=>?!@

.1*79,C0/0,21(65,24/,)-D(1

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&ZJ1((((&Z1&!(&ZJ0(;&Z!(

!"#$%细胞模型进行中和活性鉴定。结果如表#所示，单抗#Q&(和/Q&可阻断N/O&J假病毒对细胞的感染，其中和滴度分别为&Z!(07(和&Z7&"!(。QDBV6DBBC>)检测结果显示这两株单抗与OK/具有很好的反应性，而与OK/的煮沸后样品的反应性则有显著下降，说明其识别的表位依赖于特定的空间构象。

!G：AD>@D<H=BCD>=6；K：6C>5=<R

"<E

=>?!@中和单抗的筛选

对本实验室用重组N/O&JK&OK/免疫筛选获得的&7株抗N/O&JK&单抗用N/O&J假病毒感染

$讨论

预防疫苗的免疫保护性主要体现于是否可诱导

出高滴度中和抗体，因此对抗体的中和活性测定是疫苗评估和质控的重要依据。由于N/O的感染和

DD9

(4,&!5!’-6*&#$-71,-"!)4&-$-23生物工程学报@<<B，%26:@@，32:B

复制具有细胞分化状态依赖性和严格的宿主特异性，使其缺乏合适的动物模型，也难以通过常规的组

［!"］

，成为织培养方法在体外建立细胞感染培养模型

#$%疫苗开发的主要障碍之一。

表!不同单抗的抗体滴度和中和滴度

"#$%&!’()*$+,-)*)&./#(,(&0).#%*1*(2)*)&./

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应用密码子优化后的多困难。@<<9年C4HL等

#$%结构蛋白表达质粒与报告质粒通过脂质体共转染@DEMM细胞后可有效获得包装报告质粒的#$%假病毒。本研究选用@DEKM细胞替代@DEMM细胞。@DEKM细胞是一种在@DEK细胞基础上经过改进的细胞系，具有很高的生长倍增速率。另外，@DEKM细胞对脂质体或磷酸钙转染方法具有很高的转染效

可支持带有率，同时细胞内可表达,%9<大M抗原，

有利于提高质粒,%9<20.的质粒进行游离型复制，

［!D］

的拷贝数，因此十分适宜于进行蛋白表达。本研究利用磷酸钙方法在@DEKM细胞中成功建立携带

并用于)NK$报告质粒的#$%!B假病毒生产体系，

在效果和使用成本的综合#$%!B抗体的中和实验，

比较上具有明显的优势。本研究建立的#$%!B假病毒中和实验为快速准确鉴定#$%单抗的中和能力和#$%候选疫苗的免疫保护效果提供了有效手段，对于#$%疫苗的开发和质控具有的重要价值。该体系具有效率高、成本低、操作简便和易于检测等优点，适合于进行大量生产和应用，也为构建其它型的#$%假病毒提供了基础。

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人们已提出多种方法以试图解决该问题。通过

［@］

免疫缺陷小鼠异种移植方法或在体外培养的诱导

［E］

可用分化上皮组织中进行少量的体外#$%感染

于进行中和实验，但这些方法的技术复杂性和漫长的实验周期使其难以满足疫苗研发中大量中和性评估实验的需要。目前许多#$%的中和实验是通过替代方法进行的，如利用#$%%*$进行的)*+,’检［!F］［9］测和血凝抑制实验等，其分别是通过检测抗体

结合%*$的能力或对其血凝特性的抑制效率来反映抗体的中和能力。这些方法相对较为简单，灵敏度也较好，但都不能直接反映抗体对病毒感染的阻断作用，而且会产生较多的假阳性结果，如常检出识别线性表位的非中和抗体，因此其结果不能完全真实地表现抗体的中和能力。

细胞内表达的#$%结构蛋白*!和*@具有组装为病毒颗粒的特性，可包裹细胞内的游离体病毒

利用该特性构建的G3’或外源导入的报告质粒，

#$%假病毒可用于有效模拟#$%与宿主细胞的相

［F］

互作用过程。在早期主要应用重组痘苗病毒、重

［A］［B，D］

和化学偶联等方法构建#$%假病毒，组,K%

但这些方法普遍存在操作复杂、生产效率低、实验周期长、稳定性差等问题，在大规模推广应用上存在很

［!E］

卢五迅等：人乳头瘤病毒!V型假病毒中和实验的建立和初步应用

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