实验8  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr

原理

    蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品，则蛋白质分子中的二硫键被还原，1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。由于SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量的负电荷，其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离，有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。

用这种方法测定蛋白质的Mr，简便、快速，只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。所得的结果，在Mr为15000~200000的范围内，与用其他方法测得的Mr相比，误差一般在±10%以内。因此SDS测定Mr的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。

    实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。在一定的条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。

  在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时，应注意以下几个问题：

1.    如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：⑴二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作为还原剂。在有些情况下，还需要进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。⑵溶液中的SDS浓度：溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需达10倍以上。⑶溶液的离子强度：溶液的离子强度应很低，最高不能超过0.26，因为SDS在溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS具有较高的平衡浓度。

2.    不同的凝胶浓度适用于不同的Mr范围，Weber 的实验指出，在5%的凝胶中，Mr25000~200000的蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10000~70000Mr蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10000~50000Mr的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于Mr更高的蛋白质。

    可根据所测Mr范围选择最合适凝胶浓度，并尽量Mr范围和性质与待测样品相近的蛋白质做标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率）最好在0.2~0.8之间均匀分布。

    在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定Mr，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

3.    有许多蛋白质，由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS与巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的Mr而不是完整分子的Mr。为了得到更全面的资料，还必须用其他方法测定其Mr及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果相对照。

4.    不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其Mr，已发现有些蛋白质用这种方法测出的Mr是不可靠的.这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。例如组蛋白F₁，它本身带有大量的正电荷，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，她Mr是21000，但SDS-凝胶电泳测得的结果却是35000。因此在分析SDS-凝胶电泳所测得的结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的Mr，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定Mr，也可使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS凝胶中电泳，得到Ferguson图。如果待测样品的自由迁移率m₀与标准蛋白质的m₀基本交于一点，而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的Mr都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其 Mr。

    现在常用做SDS-凝胶电泳的缓冲系统有好几种，有连续系统的也有不连续系统的。

操作方法

一 贮液及凝胶溶液的配置方法，参照聚丙烯酰胺凝胶电泳中的贮液配制方法，只是在分离胶和浓缩胶液中加入SDS，使SDS的浓度达到0.4%，电极缓冲液中SDS浓度达到1mg./ml,样品缓冲液中的SDS浓度为2g/100ml.

    SDS-凝胶电泳可采用垂直柱型，也可采用垂直板型。由于垂直板型电泳操作方便，样品泳动的起点一致，便于对样品的分离情况做比较，目前大多采用此型。

二 样品的制备

    一般是将样品溶解在含1%SDS、1%巯基乙醇的0.01mol/L,pH7.2的磷酸缓冲液中，在100℃加热2~5分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.05~1mg/ml。

    也可以将上述溶液在37℃保温2小时而不是100℃加热。一般说来，两种处理的结果都一样。但如果蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37℃保温处理就会引起样品的水解，使测定失败，而100℃加热3分钟一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需采用特殊的样品处理方法。

1.    标准蛋白样品的制备

    称取细胞色素c、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0.2mg左右，分别放入小试管中，按0.5mg/ml溶液的比例，向样品中加入“样品溶解液”（见试剂的配制），使充分溶解，轻轻盖上软木塞（不要盖紧，以免加热时迸出），将小试管放入沸水浴中加热3分钟，取出冷至室温。

2.    待测蛋白质样品的制备

    固体样品的制备与标准蛋白质相同。

    如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高1倍，将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。若待测溶液太稀可事先浓缩：若溶液的含盐量太高，则需先行透析。

    处理好的样品即可用于电泳。每个凝胶样品孔内加5μg蛋白质（或更少）便可得到清晰的区带。

    处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长的时间，使用前在100℃水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。

三 电泳

    将聚合好的凝胶连同制胶模具装置在电泳槽上，拔掉样品槽模板（梳子），用电泳缓冲液清洗样品孔，然后将上下电极槽注满缓冲液，检查上槽无泄露，即可加样。

    用微量注射器按号向凝胶样品孔中加样，没孔加20μl（含蛋白质1~5μg），稀的样品可适量增加其体积。

    加样完毕后，打开直流稳压电源（负极接上槽，正极接下槽，事先接好），将电流调至50~80mA（根据凝胶板的横截面积适当调节增减），保持电流强度不变，待染料（染料已事先加在“样品溶解液“中）迁至距凝胶下端约1cm处，停止电泳。

四 染色、脱色

    将凝胶取出，滑入一白瓷盘或大培养皿中，在染料区的中心插入细铜丝做为标志，加入染色液，染色1小时左右。倾出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换液一次，直至背景清晰。

五 Mr的计算

    通常以相对迁移率m_R来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：

    用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离见图3，按下式计算：

            相对迁移率m_R=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离（cm）

    以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率做图，得到标准曲线如图4所示，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。

  

                       图3、4

试剂和器材

试剂

1.标准蛋白质（纯品）

2. 0.2mol/l,pH7.2磷酸盐缓冲液：取280ml 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，加入720ml0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液，混匀后调pH至7.2。此溶液用来进一步配置凝胶缓冲液、电极缓冲液和样品溶解液。

3.样品溶解液：0.01mol/ L,pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法如下：

       SDS                       100mg

       巯基乙醇                   0.1ml

       甘油                       1ml

       溴酚蓝                     2mg

       试剂2                     0.5ml

       加蒸馏水至总体积           10ml

4.电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液（或Tris-HCl缓冲液）：取1g SDS，加入500ml试剂2，用蒸馏水定容到1000ml.

5.染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入454ml 50%甲醇和46ml冰乙酸。

6.脱色液：75ml冰乙酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。

7.SDS：市售化学纯SDS需要结晶后使用。重结晶的方法如下：称取20gSDS，放入50ml圆底烧瓶中，加约半牛角匙活性炭及300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管。在水浴上加热到乙醇微沸，回流约10分钟，用热过滤漏斗趁热过滤。滤液应是无色透明。滤液冷至室温后，移至－20℃冰箱中过夜。次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量－20℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40℃以下烘箱烘干。

简明操作方法

1.将成套的两块玻璃板正确防如硅胶条中，然后夹在电泳槽中，按对角线顺序旋紧螺丝，

 注意用力均衡以免夹碎玻璃。安装好电泳槽后，用1.5%琼脂封底，待琼脂凝固后即可制

 胶。

2.将已经配制好的分离胶液轻轻混匀后，灌入玻板胶腔中至适当高度，表面加一薄层蒸馏水或双蒸水封闭胶液表面。开始加入水后，会在凝胶液和水之间形成分界线，在聚合过程中，分界线会逐渐消逝，待分界面再次出现时，说明分离胶已经聚合完全。

3.待分离胶聚合后，倒掉表面的水，再将配制好的浓缩胶轻轻混匀后灌满玻璃板胶腔，迅速插入样品梳，静置聚合。

4.待测样品用样品缓冲液制成0.5~1.0mg/ml左右的溶液，在沸水浴中加热3~4分钟，冷却后点样。

5.浓缩胶聚合后，拔掉样品梳，装好电泳槽，在上下槽中注入电极缓冲液，用微量注射器点样，每个样品槽中点样20~40μl。如果样品浓度太低，可以适当加大点样量。

6.上槽为负极，下槽为正极，连接好电泳仪电源，用恒压（100V）或恒流（30mA）左右电泳，也可以在样品通过浓缩胶后，加大电压到250V进行电泳。当指示剂染料溴酚蓝到达凝胶前沿还有1~2cm时停止电泳，倒掉电极缓冲液(上槽中的电极缓冲液还可重复利用，可以对它进行回收),剥胶染色。

7.剥胶后用蒸馏水洗涤胶片，然后浸入染色液中4~5小时或过夜.取出后置脱色液中振荡脱色。脱色过程中要更换脱色液几次,至背景清晰透明为止。

8.凝胶干燥：先在一块板上铺一张用水浸润透的玻璃纸，放上胶片，再盖一张同样处理过的玻璃纸，（有时为避免凝胶在干燥过程中干裂，可以在胶片的表面滴几滴甘油），用玻璃棒赶出可能窝藏的气泡。然后把玻璃纸多余的四边反向贴到玻璃板的后面，室温下在暗处自然风干，制成可以长期保存的透明干胶。

器材

1.电泳槽：垂直板型电泳槽

2.电泳仪：直流稳压电源，电流100mA，电压400~500V

 

第二篇：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量

一实训目的

1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤

2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理

二实训原理

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X10⁴～16.5X10⁴之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。   

LogMW＝K－bm

(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.

三、实训器材

          

配制方法

1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。

2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。

3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。

4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。

5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8  I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。

6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8  I=0.01M，2％SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS， 4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。

7、固定液：57.0克TCA，17.0磺基水杨酸，150毫升甲醇，加水350毫升混匀。

或25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。

8、染色液：1.25克考马斯亮兰R-250，227毫升甲醇，227毫升水，46毫升冰乙酸混匀，滤纸过滤。

9、脱色液：10％乙醇-70％醋酸。100毫升乙醇，70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。

10、保存液：10％乙醇-10％醋酸-10％甘油，100毫升乙醇，100毫升醋酸，100毫升甘油加水混匀定容至1000毫升。

11、指示染料液：0.1溴酚兰(BPB)，100毫克溴酚兰溶于100毫升水中。

四、实训步骤

（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳

1. 电泳槽的安装：

干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。
2. 样品处理：

将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～4min，待冷却后作点样用。
3. 制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5％的分离胶，（为小孔胶，进行电泳和分子筛分离）

1、分离胶的制备：10％（催化剂过硫酸铵，加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）

        试   剂                分离胶 （10％）（单位：ml）

A液                         3

C液                         1.85

蒸馏水                       3.5

1%TEMED                    0.6

            E                             0.05             

总量9ml，化学聚合30－60分钟

2、浓缩胶的制备：4.5％为大孔胶，进行样品浓缩，

        试   剂                浓缩胶 （10％）（单位：ml）

A液                       0.43

C液                       1.25

蒸馏水                     0.9

1%TEMED                  0.25

              E                         0.015                 

总量2.845ml，光聚合30－60分钟（催化剂核黄素，加速剂（TENED）

混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2～3mm水层，静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。
4. 点样：

用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5μl，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液25μl，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。
5. 电泳：

加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～100伏之间，约3～4h后，指示剂达到距前沿1～2cm时，可终止电泳。
6. 固定：

胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。
7. 染色：

取出凝胶板，测定胶长（D1）后，加入染色液染色2h。
8. 脱色

将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长（D2）。
（二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算
根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm＝d2d1×D1D2以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。

五、实训结果

分离胶未凝固

六、实训结果分析

1、加入催化剂过硫酸铵的量或浓度不够，导致分离胶的聚合时间过长，可适当加大过硫酸铵的量或增大过硫酸铵的浓度，

2、操作的室温温度过低，延长聚合时间，必要时可用电炉在电泳槽旁加热，缩短聚合时间

3、过硫酸铵过期，起不到催化作用

4、垂直玻璃板的底部应与底部橡胶边缘紧密结合，避免分离胶凝固就漏胶。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱