空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准

1、 目的：

检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标，生产区域环境当中病原微生物的监控，达到规定标准，以控制食品成品的质量。

2、 参照标准：

中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979－1995、《HACCP原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》GB/T 18204.1－2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。

3、 采样与检测方法：

3.1空气的采样与测试方法

3.1.1样品采集：

(1)取样频率：

a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行采样，以便了解车间卫生清扫消毒情况。 b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行采样。

c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点，整改后再进行采样检验。

d)实验性新产品，按客户规定频率采样检验。

e)正常生产状态的采样，每周一次。

（2）采样方法

在动态下进行，室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1 m；室内面积超过30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(约桌面高度)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于0～4℃条件时，送检时间不得超过24h。

3.1.2菌落培养：

（1）在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃ 培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。

（2）将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。

（3）菌落计算：

a) 记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不可遗漏。

b) 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。

3.2工作台（机械器具）表面与工人手表面采样与测试方法：

3.2.1样品采集：

(1)取样频率：

a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车间卫生清扫消毒情况。

b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。

c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。

d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。

e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。

f)正常生产状态的擦拭，每周一次。

（2） 采样方法：

a) 工作台（机械器具）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取与食品直接接触或有一定影响的表面）取25cm2 的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

b) 工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

（3）采样注意事项：

擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间

3.2.2 细菌?大肠菌群的检测培养:

样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1：10稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1：10样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1：100稀释液。

3.2.2.1 细菌总数：

（1）以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。

（2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃ 培养48 h后计数。

（3）结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数

3.2.2.2大肠菌群：

（1）平板法:

a) 以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的去氧胆酸盐琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。待琼脂凝固后,再覆盖一层培养基，约3-5 ml。

b) 待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃ 培养24h后计数。

c) 结果计算： 以平板上出现紫红色菌落的个数乘以稀释倍数得出。

d) 结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数

（2）试管法:

a) 以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到BGLB肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

b) 置BGLB肉汤管于36℃±1℃培养48±2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

c) 结果报告：按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每25cm2食品接触面中或每只手的大肠菌群值。

3.2.3 金黄色葡萄球菌检测

（1）定性检测

a) 取1ml 稀释液注入灭菌的平皿内，倾注15-20ml的B-P培养基，（或是吸取0.1稀释液，用L棒涂布于表面干燥的B-P琼脂平板），放进36±1℃的恒温箱内培养48±2小时。 b) 从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作血浆凝固酶实验。

c) 结果报告：B-P琼脂平板的可疑菌落作血浆凝固酶实验为阳性，即报告手（工器具）上有金黄色葡萄球菌存在。

（2）定量检测

a) 以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到含10﹪氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤

培养基中，每个稀释度接种三管。

b) 置肉汤管于36±1℃的恒温箱内培养48小时。划线接种于表面干燥的B-P琼脂平板，置36℃±1℃ 培养45～48小时。

c) 从B-P琼脂平板上，挑取典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落接种肉汤培养基，36℃±1℃培养20～24小时。

d) 取肉汤培养物做血浆凝固酶试验，记录试验结果。

e) 报告结果：根据凝固酶试验结果，查MPN表报告每25 cm2食品接触面中或每只手的金黄色葡萄球菌值。

3.3工厂环境中病原体的检测计划与方法

检测计划：为了保证食品安全，工厂应该对生产环境中的病原微生物进行检测和评估，检测项目包括李斯特菌，沙门氏菌等病原体微生物，化验室应该按照一定的计划对生产场所环境中的病原体进行检测，其中包括地面、下水道、 排水沟、墙壁、天花板、设备框架、运输的支架，冷藏装置、速冻机、传送带、设备的螺丝、维修工具等部位。当某个点检测到病员微生物时，应该对环境中的相似点加大检测频率；在把所有的预定点检测完后，应该对环境中的病原微生物的存在状况进行全面评估，在下一次环境检测循环过程中加强检测容易出现病原体的环境点，达到持续改进的目的。

检测频率: 每月两次,每次每个区域至少选取5个检测点,分别进行检测。

3.3.1 环境李斯特菌的检测方法（3MTM PetrifilmTM 环境李斯特菌的测试片）

3.3.1.1 用涂抹棒，海绵或者其他采样设备收集环境样本。

3.3.1.2 将收集的样本添加10毫升灭菌的缓冲蛋白胨水，将样本与缓冲蛋白胨混合1分钟，将样品置于室温（20-30℃）1小时，最久不超过1.5小时，以修复损伤的李斯特菌。

3.3.1.3 将测试片放在平坦处，掀起上层膜。

3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升样品到下层膜中央，将上层膜缓慢盖下，以免产生气泡。

3.3.1.5 轻轻将塑料压板放在位于接种区上层膜上，不要压，扭转或者滑动压板。提起压板等至少十分钟，以使胶体凝固。

3.3.1.6 将测试片透明面朝上，可叠放至十片，在37℃±1℃培养26-30小时，可以用标准菌落记数器或者其他光学放大器判读，不要记数圆形轮廓上的菌落，因为他们不受选择性培养基的影响。

3.3.1.7 对于定性检测，根据紫红色菌落是否存在，结果记为检出或者未检出。

3.3.2 环境中沙门氏菌的检测方法

3.3.2.1采样地点: 选取采样点时因尽量选取微生物容易滋生的地方

冷冻车间 FD车间

东区初加工 传递窗口表面、排水沟、

排水沟出口、墙壁、地面 卸料间 墙壁、墙角、地面、天花板、

物料车表面

东区精加工 地面、墙壁、墙角、排水沟、

排水沟出口、速动机链条、天花板 暂存间 墙壁、地面、天花板、墙角、墙缝 西区初加工 传递窗口表面、地面、墙壁、

排水沟、排水沟出口 挑选间 墙壁、地面、天花板、墙角、垫板

西区精加工 地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板 包装室 墙壁、地面、天花板、金探传送带表面、落地料存放处

3.3.2.2 操作步骤

3.3.2.2.1采样应在生产开始后进行，用已浸润过的棉拭在选定的被测表面旋转涂抹约100cm2的面积，然后将棉拭放回涂抹试管并盖紧。

3.3.2.2.2将样品带回实验室，每5个点混合成一个样品, 登记编号,按照SN0170-92标准及时检测，若有阳性结果出现，应逐步对所混合的每个点分别检测。

 

第二篇：食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验

附件

食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗

1

2 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。 檢驗方法〆

2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換

氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。

2.2

2.2.1

2.2.2

2.2.3

2.2.4

2.2.5

2.2.6 器具及材料〆 乾熱滅菌器。 高壓滅菌釜。 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。 冰箱〆能維持5 ± 3℃者。 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL

之刻度。

2.2.7

2.2.8 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅

菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。

2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其

他缺點。

2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍

或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。

2.2.11

2.2.12

2.2.13

2.2.14 pH測定儀。 培養箱〆能維持內部溫度在± 1℃以內者。 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在 ± 0.2℃以內者。

2.2.15

2.2.16

2.2.17 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。 試管〆10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm試管，或

其他適用者。

2.2.18

2.2.19

2.2.20

2.2.21

2.2.22

2.2.23

2.2.24

2.2.25 旋渦混合器（Vortex mixer）。 顯微鏡〆能放大至1000倍以上之一般光學顯微鏡。 載玻片及蓋玻片〆適用於染色及鏡檢用。 研缽、杵。 藥勺、剪刀、小刀、鑷子〆可滅菌。 濾紙及褐色試藥瓶。 無菌濾膜〆孔徑0.45 μm或以下之親水性醋酸纖維膜。 杜蘭發酵管（Durham fermentation tube）〆外徑9 × 22 mm或其他適用者。

2.2.26 試藥〆氯化鈉、硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）、膽鹽No. 3（bile salts No. 3）、中性

紅（neutral red）、結晶紫（crystal violet）、檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate）、去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate）、硫代硫酸鈉（sodium thiosulfate）、草酸銨（ammonium oxalate）、碘化鉀、碘、沙黃O（safranin O）、對-二甲胺基苯甲醛（p-dimethyl aminobenzaldehyde）、四甲基對位苯二胺鹽酸鹽（N,N,N',N'-tetramethyl -ρ-phenylenediamine?2HCl）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）、硝基苯哌喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）、亮綠（brilliant green）、酚紅（phenol red）、溴甲酚紫（bromcresol purple）、溴麝香草藍（bromthymol blue）、肌酸（creatine）、甲基紅（methyl red）、α-萘酚（α-naphthol）、氫氧化鉀、95%乙醇、無水乙醇、戊醇（amyl alcohol）或異戊醇（isoamyl alcohol）、乳糖、蔗糖、半乳糖醇（dulcitol）、核糖醇（adonitol）、棉子糖（raffinose）、山梨醇（sorbitol）、阿拉伯糖醇（D-arabitol）、氰化鉀、氫氧化鈉、L-離胺酸（L-lysine）、L-鳥胺酸（L-ornithine）、L-精胺酸（L-arginine）、礦物油或液態石蠟油（paraffin oil）及鹽酸等均採用化學試藥級。

2.2.27 試劑〆

2.2.27.1 無菌蒸餾水〆

蒸餾水900 mL、90 mL、9 mL，分裝於增菌容器或試管中，以121℃滅菌15分鐘。

2.2.27.2 0.85%生理食鹽水〆

取氯化鈉8.5 g溶於1000 mL蒸餾水中，分裝於試管內，以121℃滅菌15分鐘。

2.2.27.3 柯瓦克氏試劑（Kovacs’ reagent）〆

取對-二甲胺基苯甲醛5 g溶於戊醇或異戊醇75 mL中，再徐徐加入鹽酸25 mL，混

合均勻後應呈黃色並須保存於4℃冰箱中。

2.2.27.4 甲基紅指示劑（Methyl red indicator）〆

取甲基紅0.1 g溶於95%乙醇300 mL後，再加蒸餾水使成500 mL。

2.2.27.5 歐普氏試劑（Voges-Proskauer test reagents, VP reagents）〆

溶液A〆取α-萘酚5 g溶於無水乙醇100 mL中。

溶液B〆取氫氧化鉀40 g溶於蒸餾水中，並使成100 mL。

2.2.27.6 0.5%氰化鉀溶液（0.5% potassium cyanide solution）〆

取氰化鉀0.5 g溶於無菌蒸餾水100 mL中（氰化鉀為劇毒物質，本操作務必在抽氣

櫃內進行）。

2.2.27.7 礦物油或液態石蠟油〆

取礦物油或液態石蠟油20～50 mL，裝入有蓋容器中約1/2滿，以121℃滅菌30分鐘。

2.2.27.8 革蘭氏染色液（Gram stain solution）〆

2.2.27.8.1 哈克氏（Hucker’s）結晶紫液（初染劑）〆

溶液A〆取結晶紫2 g溶於95%乙醇20 mL中。

溶液B〆取草酸銨0.8 g溶於蒸餾水80 mL中。

將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。

2.2.27.8.2 革蘭氏碘液（媒染劑）〆

取碘化鉀2 g及碘1 g置於研砵中，經研磨5～10秒鐘後，加蒸餾水1 mL研磨，次加蒸餾

水5 mL研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研砵及杵後，併入洗液，加蒸餾水使成300 mL。

2.2.27.8.3 哈克氏複染液（複染劑）〆

取沙黃O 2.5 g溶於95%乙醇100 mL中，供作複染原液。使用時，取原液10 mL加蒸餾水

90 mL，作為複染液。

註〆革蘭氏染色液因放久可能失效，因此若購買成品時，要注意其保存期限，若自行配製者應

檢查其染色效果。

2.2.27.9 氧化酶試劑（Oxidase reagent）〆

取四甲基對位苯二胺鹽酸鹽1 g溶於蒸餾水100 mL後，貯存於褐色瓶，並置入冰箱中，

使用期限以不超過1星期為宜。

2.2.27.10 1 M磷酸二氫鈉溶液〆

取磷酸二氫鈉6.9 g溶於蒸餾水45 mL中，徐徐注入30%氫氧化鈉溶液約3 mL，

調整pH值為7.0，續加入蒸餾水使成50 mL，貯存於4℃冰箱中備用。

2.2.27.11 硝基苯哌喃半乳糖試劑（ONPG reagent）〆

取硝基苯哌喃半乳糖80 mg溶於37℃蒸餾水15 mL中，再加入1 M磷酸二氫鈉溶

液5 mL，即為0.0133 M硝基苯哌喃半乳糖試劑，貯存於4℃冰箱中，使用時須加溫至

37℃。

2.2.28 培養基〆

2.2.28.1 蛋白腖緩衝液（Buffered peptone water, BPW）

蛋白腖（peptone） 10 g

氯化鈉（NaCl） 5 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 3.5 g

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.5 g

蒸餾水 1000 mL

攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ± 0.2。

2.2.28.2 加鹽硫酸月桂酸胰化蛋白

胰化蛋白

培養液（Lauryl tryptose broth with 2% NaCl, 2% NaCl-LST） （tryptose） 20 g

5 g 乳糖（lactose）

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g

氯化鈉（NaCl） 20 g

硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）

蒸餾水 1000 mL 0.1 g

加熱溶解後，分取10 mL注入裝有杜蘭發酵管之試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終

pH值為6.8 ± 0.2。

2.2.28.3 紫紅膽鹽葡萄糖培養基（Violet red bile glucose agar, VRBG）

酵母抽出液（yeast extract） 3 g

蛋白腖（peptone） 7 g

氯化鈉（NaCl） 5 g

膽鹽No. 3（bile salts No. 3） 1.5 g

乳糖（lactose） 10 g

0.03 g 中性紅（neutral red）

結晶紫（crystal violet） 0.002 g

洋菜（agar） 15 g

葡萄糖（glucose） 10 g

蒸餾水 1000 mL

加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度。於45～50℃水浴中冷卻，最終pH值為7.4 ±

0.2。每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。配製後之培養基應放置於2～8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。

2.2.28.4 阪崎腸桿菌培養基（Enterobacter sakazakii agar, ESA）

胰化蛋白腖（tryptone） 15 g

大豆蛋白腖（soya peptone） 5.0 g

氯化鈉（NaCl） 5.0 g

檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate）

去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate）

硫代硫酸鈉（Na2S2O3〃5H2O） 1.0 g 1.0 g 1.0 g

5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷

（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）

洋菜（agar） 15 g

蒸餾水 1000 mL 0.1 g

攪拌加熱溶解後，以121℃，滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ± 0.2。冷卻至50℃，

每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。

2.2.28.5 腸內細菌科增菌培養液（Enterobacteriaceae enrichment broth, EE broth）

蛋白腖（peptone） 10 g

葡萄糖（glucose） 5 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 8 g

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2 g

牛膽鹽（ox-gall） 20 g

亮綠（brilliant green） 0.015 g

蒸餾水 1000 mL

加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度，最終pH值為7.2 ± 0.2。取90 mL注入約125

mL已滅菌之附蓋三角錐瓶或廣口瓶中，配置後之培養液應放置於2～8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。

2.2.28.6 胰化酪蛋白大豆培養基（Trypticase soy agar, TSA）

胰化酪蛋白腖（trypticase peptone） 15.0 g

植物蛋白腖（phytone peptone）

氯化鈉（NaCl） 5.0 g 5.0 g

洋菜（agar） 15 g

蒸餾水 1000 mL

平板培養基配製方法〆攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ±

0.2。冷卻至50℃，每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用々斜面培養基配製方法〆加熱溶解後，分取約5 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ± 0.2。滅菌後作成斜面培養基，斜面長度約4～5 cm，斜面底部之深度約2～3 cm。

2.2.28.7 尿素培養液（Urea broth）

尿素（urea） 20 g

酵母抽出物（yeast extract） 0.1 g

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 9.1 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 9.5 g

酚紅（phenol red） 0.01 g

蒸餾水 1000 mL

溶解後，經孔徑0.45 μm濾膜過濾後，分取1.5～3 mL濾液，注入已滅菌之試管中，

最終pH值為6.8 ± 0.2。

2.2.28.8 運動性試驗培養基（Motility test medium）

牛肉抽出物（beef extract）

蛋白腖（peptone） 10 g

氯化鈉（NaCl） 5 g

洋菜（agar） 4 g

蒸餾水 1000 mL 3 g

加熱溶解後，分取約8 mL注入附有螺旋蓋試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH

值為7.4 ± 0.2。

2.2.28.9 氰化鉀培養液（Potassium cyanide broth）

聚蛋白腖（polypeptone） 3 g

氯化鈉（NaCl） 5 g

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.225 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 5.64 g

蒸餾水 1000 mL

溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.6 ± 0.2。冷卻後於抽氣櫃內以吸管

輔助器配合無菌操作，加入0.5%氰化鉀溶液15 mL，混合均勻，分取1～1.5 mL注入已滅菌之試管中，貯存於冰箱備用，貯存期限不得超過兩週（操作氰化鉀溶液時，需戴手套且不可用口吸取）。

2.2.28.10 胰化蛋白腖培養液（Tryptone broth）

胰化蛋白腖（tryptone）或胰化酪蛋白腖（trypticase）

蒸餾水 1000 mL 10 g

溶解後，分取約5 mL注入試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9 ± 0.2。

2.2.28.11 MR-VP培養液（MR-VP broth）

蛋白腖緩衝液粉末（buffered peptone-water powder） 7 g

葡萄糖（glucose） 5 g

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 5 g

蒸餾水 1000 mL

溶解後，分取約10 mL注入試管中，以118～121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9 ±

0.2。

2.2.28.12 溴甲酚紫培養液（Bromcresol purple broth）

蛋白腖（peptone） 10 g

牛肉抽出物（beef extract）

氯化鈉（NaCl） 5 g

溴甲酚紫（bromcresol purple） 0.04 g

蒸餾水 1000 mL 3 g

溶解後，分取約2.5 mL注入試管內，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.0 ± 0.2。

冷卻後，每管加入經0.2 μm孔徑濾膜過濾除菌之50%（w/v）蔗糖溶液0.278 ± 0.002 mL，使培養液中該糖之最終濃度為5%（w/v）。含半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、山梨醇及阿拉伯糖醇之溴甲酚紫培養液配製方法亦同。

2.2.28.13 脫羧酶基礎培養液（Decarboxylase basal medium）

蛋白腖（peptone） 5 g

酵母抽出物（yeast extract） 3 g

葡萄糖（glucose） 1 g

溴甲酚紫（bromcresol purple） 0.02 g

蒸餾水 1000 mL

加熱攪拌溶解後，取L-離胺酸5 g溶解於上述之培養液中，混合均勻，分取適量注入

試管內，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為6.5 ± 0.2，使成離胺酸脫羧酶培養液。含L-精胺酸及L-鳥胺酸之脫羧酶培養液配製方法亦同。對照組之配製，除脫羧酶基礎培養液外，不需添加任何物質。

2.2.28.14 辛蒙斯檸檬酸鹽培養基（Simmons citrate agar）

氯化鈉（NaCl） 5 g

檸檬酸鈉（Na3C6H5O7） 2 g

磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1 g

磷酸二氫銨（NH4H2PO4）

硫酸鎂（MgSO4） 0.2 g

溴麝香草藍（bromthymol blue）

洋菜（agar） 15 g

蒸餾水 1000 mL 0.08 g 1 g

加熱溶解後，分取約5 mL注入試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8 ± 0.2。

滅菌後作成斜面培養基，此斜面長度約4～5 cm，斜面底部深度約2～3 cm。

2.3 檢液之調製〆

2.3.1 奶粉檢體（包括嬰兒配方奶粉、特殊營養配方奶粉、幼童專用奶粉及成人奶粉）〆用振搖方

式，使充分均勻混合後，以已滅菌之藥勺或其他方便使用之用具，取100 g、10 g及1 g，分別加入內含預熱至45℃之無菌蒸餾水900 mL、90 mL及9 mL之2 L、250 mL及125 mL三角錐瓶中（三重複）。以上三角錐瓶得以其他耐濕熱滅菌之塑膠材質容器或玻璃試管替代，唯檢液體積以不超過容器總容量二分之一為原則。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，於35℃培養18～24小時，供作檢液。因檢液於增菌培養過程可能產氣，故不可緊鎖螺旋瓶蓋（或試管蓋），宜維持鬆動但不脫落狀態。

2.3.2 液態食品檢體〆充分均勻混合後，取100 mL、10 mL及1 mL，分別加入內含900 mL、90 mL

及9 mL已滅菌之蛋白腖緩衝液。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，於35℃培養18～24小時，供作檢液。

2.3.3

2.3.3.1 環境檢體或塗抹物檢體〆 環境檢體〆取1 g置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，於44℃培養18～24小

時，供作檢液。

2.3.3.2 塗抺物檢體〆將塗抹棒之頭部置於已滅菌試管內，以無菌操作折（剪）斷塗抹物木柄，

添加蛋白腖緩衝液5 mL後，將試管蓋旋緊，於10秒內來回叩擊手心使其劇烈振盪（振

盪幅度需達15公分）50次，或以旋渦混合器充分振盪至塗抹物頭部之棉絮鬆開。取溶出

液1 mL置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，於44℃培養18～24小時，供作檢

液。

或將塗抹棒之頭部置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，以無菌操作折（剪）

斷塗抹物木柄，於44℃培養18～24小時，供作檢液。

2.4

2.4.1 鑑別試驗〆 選擇性增菌培養〆吸取2.3節之檢液10 mL，加入內盛有腸內細菌科增菌培養液90 mL之160

mL稀釋瓶中。混合均勻後於35℃培養18～24小時。

2.4.2 分離培養〆

2.4.2.1 方法一〆自2.4.1節之腸內細菌科增菌培養液中取一接種環量，在VRBG及ESA培養基表

面劃線後（二重複），於35℃培養18～24小時，觀察所形成菌落之形態。阪崎腸桿菌在

VRBG培養基上的典型菌落為外緣規則平整，呈淡粉紅色或紫紅色，外緣通常伴有紫紅

色之膽酸（bile acids）類物質沉殿環生成々阪崎腸桿菌在ESA培養基上的典型菌落為外

緣規則平整，呈綠色。自VRBG及ESA培養基上鉤取可疑菌落，劃線於TSA平板培養基，於35℃培養18～24小時後，進行下列初步生化試驗。

2.4.2.2 方法二〆自2.4.1節之腸內細菌科增菌培養液中吸取1 mL量，加入內盛有生理食鹽水9 mL

之試管中，進行系列稀釋，使增菌培養液稀釋至原來的10～10倍。每一管（含未稀釋-4-6

之培養液）分別以無菌吸管吸取0.1 mL量，以曲玻棒均勻塗於VRBG及ESA培養基上，於35℃培養18～24小時。自VRBG及ESA培養基上鉤取可疑菌落，劃線於TSA平板培

養基，於35℃培養18～24小時後，進行下列初步生化試驗。

2.4.3 混合菌株（Mixed culture）之純化〆將VRBG及ESA培養基上之未純化菌株，以四區劃法，

劃於VRBG或ESA培養基，於35℃培養18～24小時後，鉤取典型菌落，劃線於TSA平

板培養基，於35℃培養18～24小時後，進行下列初步生化試驗。

2.5

2.5.1 鑑定試驗〆 初步生化試驗〆

2.5.1.1 氧化酶試驗（Oxidase test）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，塗抹於含有氧化酶試劑之濾紙

表面。10～15秒後變為深紫色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為氧化酶負反應。

2.5.1.2 黃色色素產生試驗（Yellow pigment production test）〆以無菌接種針挑取TSA平板培養基

上可疑菌株至少5株，分別劃於TSA斜面培養基上，以25℃培養48～72小時，觀察菌株

產生色素之情形。有黃色色素產生者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

2.5.1.3 尿素酶試驗（Urease test）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，接種於尿素培養液內，於35℃

培養24 ± 2小時。由於未接種之尿素培養液偶爾會轉變為紫紅色，故試驗時應包括未接

種之培養液作為對照用。培養液由橘紅色轉變為紫紅色者為正反應，顏色不變者為負反

應，阪崎腸桿菌為負反應。

2.5.1.4 運動性試驗（Motility test）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，穿刺接種於運動性試驗培養基

之表面中央點至深度0.5吋處。於35℃培養24小時後開始觀察直至48 ± 2小時。當測試

菌沿穿刺線呈放射線狀生長者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

2.5.1.5 革蘭氏染色（Gram stain）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，劃於TSA斜面培養基上，於35

℃培養24 ± 2小時，依下列步驟進行革蘭氏染色後鏡檢。

(１)

(２) 鉤取菌體，於載玻片上製成薄抹片，風乾或微熱固定。 初染〆將已固定之抹片，用哈克氏結晶紫液染1分鐘後水洗，水洗時間應不超過5

秒鐘。

(３)

(４) 媒染〆加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。 脫色〆以95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再以水洗，此步驟需時甚短，僅數秒即

可，惟視抹片之厚薄而定。

(５) 複染〆用哈克氏複染液複染30秒鐘，水洗。

(６)

(７) 自然風乾。 鏡檢〆呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏陰性菌。阪崎腸桿菌

為革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢之桿狀菌。

經上述試驗，判定為可疑阪崎腸桿菌者，自TSA培養基鉤菌，進行下列生化試驗確認。

2.5.2 生化試驗〆

2.5.2.1 硝基苯哌喃半乳糖苷試驗（ONPG test）〆鉤菌並置於含有已滅菌之0.85%生理食鹽水0.2 mL

之試管中，作成濃懸浮液後，再加入一片浸過硝基苯哌喃半乳糖苷試劑之紙錠，並輕輕

搖動後，於35℃培養6～24小時，紙錠變成黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿

菌為正反應。

2.5.2.2 氰化鉀試驗（KCN test）〆鉤菌接種於氰化鉀培養液，以橡皮塞塞緊試管口，於35℃培養

24小時後開始觀察直至48 ± 2小時。培養液由清澈變為混濁者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

2.5.2.3 吲哚試驗（Indole test）〆鉤菌接種於胰化蛋白腖培養液中，於35℃培養48 ± 2小時後，

加入柯瓦克氏試劑0.2～0.3 mL，輕輕搖動後靜置約10分鐘，上層呈紅色者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為負反應。

2.5.2.4 歐普氏試驗（VP test）〆鉤菌接種於MR-VP培養液中，於35℃培養48 ± 2小時後，取培

養液1 mL至另一已滅菌之試管中，加入歐普氏試劑溶液A約0.6 mL及歐普氏試劑溶液B約0.2 mL後，再加入少許肌酸，振搖均勻，經2～4小時後觀察結果，呈現粉紅色至鮮紅者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為正反應。

2.5.2.5 甲基紅試驗（Methyl red test）〆將2.5.2.4節剩餘之MR-VP培養液於35℃再培養48 ± 2

小時後，取培養液5 mL至另一已滅菌試管中，加入甲基紅指示劑5～6滴，輕輕搖勻，

呈紅色者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為負反應。

2.5.2.6 檸檬酸鹽利用試驗（Citrate utilization test）〆鉤菌接種於辛蒙斯檸檬酸鹽斜面培養基，須

在斜面上作劃線及穿刺培養，於35℃培養96 ± 2小時。斜面上有菌體生長且培養基顏色由綠色變為藍色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

2.5.2.7 精胺酸二水解酶試驗（Arginine dihydrolase test）〆鉤菌分別接種於精胺酸脫羧酶培養液及

脫羧酶基礎培養液中，接種後分別注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1～2

cm，需鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。精胺酸脫羧酶培養液呈紫色，且脫羧酶基礎培養液呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為精胺酸二水解酶正反

應。

2.5.2.8 離胺酸脫羧酶試驗（Lysine decarboxylase test）〆鉤菌分別接種於離胺酸脫羧酶培養液及脫

羧酶基礎培養液中，接種後注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1～2 cm，需鬆

蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。離胺酸脫羧酶培養液呈紫色且脫羧酶基礎培養基呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為負反應。

2.5.2.9 鳥胺酸脫羧酶試驗（Ornithine decarboxylase test）〆鉤菌分別接種於鳥胺酸脫羧酶培養液及

脫羧酶基礎培養液中，接種後注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1～2 cm，需鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。鳥胺酸脫羧酶培養液呈紫色，且脫羧酶基礎培養液呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

2.5.2.10 發酵試驗（Fermentation test）〆鉤菌接種於分別含有蔗糖、半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、

山梨醇及阿拉伯糖醇等糖類之溴甲酚紫培養液中，於35℃培養2～5天，每隔24小時觀察其發酵情形。培養液顏色由紫色轉變為黃色，產酸者為正反應。

2.6

判定〆阪崎腸桿菌陽性者，應符合表一及表二所列之結果。

表一、E. sakazakii、E. cloacae、E. aerogenes、E. agglomerans及E. gergoviae之生化反應

(1)

(１) ＋ 表示所有菌株在1～2天內為正反應々[＋] 表示大部分（89%以上）在1～4天內為正反

應々d表示依菌株而異（通常11～80 %為正反應）々－ 表示所有菌株培養7天後皆為負反應々ND表示無可引用之資料。

表二、E. sakazakii、E. cloacae、E. aerogenes、E. agglomerans及E. gergoviae之發酵試驗

(1)

(１) ＋ 表示90～100%為正反應々(＋) 表示75～89%為正反應々V 表示25～74%為正反應々(－)

表示10～24%為正反應々－ 表示0～9%為正反應。

2.7

最確數計算〆由2.6節判定為阪崎腸桿菌陽性者之各階瓶（管）數，利用接種量為每瓶（管）0.1, 0.01, 0.001（g或mL）之三階三瓶（管）最確數表（如附表），推算出阪崎腸桿菌之最確數（MPN/g或MPN/mL）。

附表 最確數表

說明〆

經腸內細菌科增菌培養液增菌培養，劃線至VRBG及ESA培養基，並挑選可疑菌落進行鑑定試驗，

確認含有阪崎腸桿菌之試瓶（管）數若為3-3-2，對照MPN數為1100，則〆

(１) 若接種量為每瓶（管）含檢體0.1, 0.01, 0.001（g或mL），則該檢體阪崎腸桿菌之最確數為

1100（MPN/g或MPN/mL）。

(２) 若接種量為每瓶（管）含檢體100, 10, 1（g或mL），則該檢體阪崎腸桿菌之最確數應為

1100÷1000＝1.1（MPN/g或MPN/mL）。

2.8

可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或生化試驗鑑定系統，惟檢驗結果有爭議時，應以傳統方法為準。