实验九 脂肪酸β-氧化
目的要求:
(1)了解脂肪酸的β-氧化作用。
(2) 掌握测定β-氧化作用的方法和原理。
实验原理:
在肝脏中,脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮,也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温,生成的丙酮在碱性条件下,与碘生成碘仿。反应式如下:
2NaOH +I2 ─→NaOI +NaI +H2O
CH3COCH3 +3NaOI ─→CHI3(碘仿)+CH3COONa +2NaOH
剩余的碘,可以用标准硫代硫酸钠滴定。
NaOI +NaI +2HCl ─→I2 +2NaCl +2H2O
I2 +2Na2S2O3 ─→Na2S4O6 +2NaI
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差,可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
试剂和器材
一、试剂
0.1%淀粉溶液;0.9%氯化钠溶液; 15%三氯乙酸溶液;10%氢氧化钠溶液。 10%盐酸溶液:浓盐酸一般浓度35%~37%,取浓盐酸277.8 mL定容到1000 mL。 0.5mol/L丁酸溶液:取5 mL丁酸溶于100 mL0.5mol/L氢氧化钠溶液中。
0.1mol/L碘溶液:称取12.7g碘和约25g碘化钾溶于水中,稀释到1000 mL,混匀,用标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定。
标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液:临用时将已标定的0.05mol/L硫代硫酸钠溶液稀释成0.01mol/L。
1/15mol/L pH7.6磷酸盐缓冲液:1/15mol/L磷酸氢二钠溶液86.8mL与1/15mol/L磷酸二氢钠溶液13.2mL混合。
二、材料
新鲜猪肝。
三、器材
锥形瓶50mL(? 2); 移液管5mL(? 5),2mL(? 45);微量滴定管5mL(? 1);漏斗;恒温水浴。
操作方法
一、肝糜的制备
称取肝组织5g置于研钵中。加少量0.9%氯化钠溶液,研磨成细浆。再加入0.9%氯化钠溶液至总体积为10mL。
二、β-氧化作用
取2个50mL锥形瓶,各加入3mL 1/15mol/L pH7.6磷酸盐缓冲液。向其中一个锥形瓶中加入2mL正丁酸,另一个锥形瓶作为对照,不加正丁酸。然后各加入2mL肝组织糜。混匀,置于37℃恒温水浴中保温。
二、沉淀蛋白质
保温1小时后,取出锥形瓶,各加入3mL15%三氯乙酸溶液,在对照瓶内追加2mL正丁酸,混匀,静置15分钟后过滤。将滤液分别收集在两个试管中。
三、酮体的测定
吸取2种滤液各2mL分别放入另两个锥形瓶中,再各加3mL0.1mol/L碘溶液和3mL10%氢氧化钠溶液。摇匀后,静置10分钟。加入3mL10%盐酸溶液中和。然后用0.01mol/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴定至浅黄色时,加入3滴淀粉溶液作为指示剂。摇匀,并继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠溶液的毫升数,并按下式计算样品中的丙酮含量。
四、计算
肝脏中的丙酮含量(mmol/g)=(A-B)×C NaSO×2231 6
式中:A为滴定对照所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数;
B为滴定样品所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数。
C NaSO为标准硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L)。 223
注意事项
(1)肝糜必须新鲜,放置过久则失去氧化脂肪酸的能力。
(2)加盐酸溶液中和时一定要准确量取,确保酸碱中和。
思考题
1. 什么是酮体?
2. 本实验如何计算样品中的丙酮含量?