实验28  脂肪酸的β一氧化

一、目的

1．了解脂肪酸的β一氧化作用

2  通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β一氧化作用的方法及其原理。

二、原理

在肝脏内脂肪酸经 β一氧化的作用生成乙酰辅酶A，两分子的乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成 β一羟丁酸。 乙酰乙酸，β一羟丁酸和丙酮总称为酮体。肝脏不能利用酮体，必须经血液运至肝外组织特别是肌肉和肾脏，再转变为乙酰辅酶A而被氧化利用。酮体作为有机体代谢的中间产物，在正常的情况下，其产量甚微，患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。

本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应滴定。在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：

2HaOH+I₂===NaOI+NaI+H₂O

CH₃COCH₃+3NaOI===CHI₃+CH₃COONa+2NaOH

碘仿

剩余的碘可用标准Na₂S₂O₃滴定

NaOI+NaI+2HCl===I₂+2NaCl+H₂O

I₂+2Na₂S₂O₃===Na₂S₄O₆+2NaI

根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。

三、材料、试剂和仪器

（一）材料

家兔（或鸡或大鼠）的新鲜肝脏

一、试剂

1．0.1%淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）

2．0.9%氯化钠溶液

3．0.5M丁酸溶液：取4.5毫升正丁酸，用1N氢氧化钠溶液中和至pH=7.6,并稀释至100毫升。

4．20%三氯乙酸溶液

5．10%氢氧化钠溶液

6．10%盐酸

7．0.1碘溶液，称取 12.7克碘和约25克碘化钾溶于水中，稀释到1000毫升，混匀，用标准0.1M硫代硫酸钠溶液标定。

8.标准0.02M硫代硫酸钠溶液：临用时将已标定的1N硫代硫酸钠溶液衡释成0.02M。

9．1/15M，PH7.6磷酸盐缓冲液：1/15M磷酸氢二钠86.8毫升与1/15M磷酸二氢钠13.2毫升混合。

（二）器具

1、匀浆器或研钵

2、剪刀、镊子、漏斗

3、50毫升锥形瓶

4、碘量瓶

5、试管和试管架

6、移液管（5毫升，10毫升）

7、微量滴定科

8、恒温水浴

四、操作步骤

（一）肝匀浆的制备

将鸡颈部放血处死，取出肝脏。用0.9%NaCl溶液洗去表面的污血后，用滤纸吸去表面溶液，称取肝组织5g ，置于研钵中加入少许0.9%NaCl溶液，将肝组织研磨成肝匀浆。再加入0.9%NaCl溶液，使肝匀浆总体积达10ml。

（二）酮体的生成

1．取锥形瓶两只，按下表编号后，分别加入各试剂。

2.将加入试剂的两只锥形瓶于43^oC恒温水浴锅中保温40min后取出。

3．于上述两锥形瓶中分别加入20%三氯醋酸3mL，摇匀后，室温放置10min。

4．将锥形瓶中的混合物分别过滤，收集滤液于事先如上编号的试管中。

（三）酮体的测定

1．取碘量瓶两只，按下表编号后加入有关试剂。

加完试剂后摇匀，放置10min。

2．于各碘量瓶中滴加10%HCl，溶液3ml，使各瓶溶液中和至中性或微酸性。

3．用0.02mol/L  Na₂S₂O₃滴定至碘量瓶中溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数滴0.1%淀粉溶液2-3滴，使瓶中溶液呈蓝色。

4．用0.02mol/L  Na₂S₂O₃ 继续滴定至碘量瓶中溶液的蓝色消褪为止。

5．记下滴定时所用去的Na₂S₂O₃溶液的毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。

（四）计算

实验中所用肝匀浆中生成的丙酮量(mmol)=(A—B)×C×1/6

肝脏生成丙硐的量（mmol·g^-1）=(A-B)×C×

式中：A为滴定A 样品所消耗的0.02mol/L Na₂S₂O₃溶液的毫升数；

B为滴定B样品所消耗的0.02mol/L Na₂S₂O₃溶液的毫升数；

C 为Na₂S₂O₃的浓度（mol/L）。

五、注意事项

1、在低温下制备新鲜的肝糜，以保证酶的活性。

2、加HCl溶液后即有I₂析出，I₂会升华，所以要尽快进行滴定，滴定的速度是前快后慢，当溶液变浅黄色后，加入指示剂就要慢慢一滴一滴的滴。

3、滴定时淀粉指示剂不能太早加入，只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终点的观察和滴点结果。

六、实验报告

保留实验的有效数据，计算结果并分析讨论。

七、思考题

1. 为什幺说做好本实验的关键是制备新鲜的肝糜？

2. 什幺叫酮体？为什么正常代谢时产生的酮体量很少？在什幺情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体？

3. 为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中丙酮的含量？

4. 实验中三氯乙酸起什幺作用？

 

第二篇：实验十二 脂肪酸的β-氧化