实验八 水中菌落总数的测定及染色观察

一、实验目的

掌握国标中关于水中细菌总数的测定基本原理和方法；熟悉水体中细菌总数的检验方法、检验原理、检验依据、数据处理和报告方法。

二、实验原理

本实验应用平板计数技术测定污水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

三、实验试剂与器材

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水；

灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，培养箱等。

四、实验步骤

(1) 水样的准备

河水，已采集。

(2) 细菌总数测定

[1]. 稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一管9 ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第五管，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30—300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。

[2]. 用灭菌吸管吸取1ml稀释水样，注入平板培养基的中心，并用无菌三角玻棒进行涂布。每个稀释度做三个平行，共做九个平皿。

[3]. 培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养48小时，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。

(3) 菌落计数方法

① 先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到

培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

② 首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。

③ 若有两个稀释度的平均菌落数均在30—300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。

④ 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。 ⑤ 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 ⑥ 若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

(4)菌落数的报告

菌落数在100以内时,按其实有数报告,大于100时,采用二位有效数字,在二位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算.为了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示。

五、思考题

（1）测定水中细菌菌落总数有什么实际意义？

（2）根据我国饮用水水质标准，讨论你这次的检验结果。

（3）本实验中哪些步骤属无菌操作？为什么？

 

第二篇：饮用水中菌落总数的测定

目 录

中文摘要 ......................................................... 2

ABSTRACT ......................................................... 2

1.引言 ........................................................... 3

2. 材料与方法 .................................................... 3

2.1实验材料 .................................................. 3

2.2培养基的配制及其灭菌 ...................................... 4

2.3主要仪器 .................................................. 4

2.4染色液的制备 .............................................. 4

2.5菌落总数的测定 ............................................ 4

2.6革兰氏染色 ................................................ 5

3结果 ........................................................... 5

3.1平板计数的结果 ............................................ 5

3.2水样中细菌总数的计算 ...................................... 6

3.3革兰氏染色结果 ............................................ 6

4.讨论 ........................................................... 7

参考文献 ......................................................... 7

致谢 ............................................................. 8

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中文摘要

摘要：本实验采用平板菌落计数法对连云港师范高等专科学校女生宿舍2A320的管道自来水，圣王桶装水及校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水分别进行了菌落总数的测定，并对其中的细菌进行培养，经过革兰氏染色和镜检，初步观察了细菌的形态和革兰氏阴阳性鉴定。实验结果表明校内管道自来水的菌落总数为66cfu/ml，符合国标GB 5749-85，超市销售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水中菌落总数分别为0.5cfu/ml、1cfu/ml、1cfu/ml,均符合国家标准GB l0789-89，而桶装水的水质不是很理想，测定的菌落总数为520cfu/ml，远超过了国标GB 19298-2003中的规定。通过本次实验，期待更多的在校师生，能够关注饮用水质量，关爱健康，增强安全用水意识。

关键词:饮用水；平板菌落计数法；菌落总数的测定；革兰氏染色

ABSTRACT

Abstract: Total number of colonies of using plate ,Lianyungang Teachers College dormitory 2A320 water pipeline, Sage Bottled Water, And school education in supermarkets sell Master Kong, unity, bottled water Jinmailang were terminated in this study by colony count method,and which the bacteria were cultured, after Gram staining and microscopy, we observed the shape of bacteria Preliminarily and Gram Identification of yin and yang The results show that the total number of campus pipeline water for the colony were 66cfu/ml, meet the national standard GB 5749-85, Master Kong supermarket sales, unity, bottled water Jinmailang total number of colonies were 0.5cfu/ml, 1cfu/ml, 1cfu/ml,meet the national standard GB l0789-89,however the water quality of bottled water is not very satisfactory, the determination of the total number of colonies were 515cfu/ml, which far exceeding the national standard GB 19298-2003 in the regulations. Through this experiment, looking for more teachers and students, to focus the quality of drinking water, health care, increased awareness of safe water.

Keywords: drinking water, lat colonies notation, The etermination of total

colonies,Gram's staining

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饮用水中菌落总数的测定

1.引言

各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原微生物主要来源于人和动物的传染性排泄物。

水是生命之源，和阳光、空气一样，是生命不可或缺、最基本、最必需的自然资源。水参与了生物体内所有的生理生化过程，同时又是体内进行系生化反应的良好场所。故水的微生物检验在保证饮水安全和控制传染病上有着重要的意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准GB 5749-85规定，菌落总数不得超过100 cfu/g(ml)，所用的方法是稀释平板计数法。

平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

根据我校的实验条件，本实验拟选用国标规定的平板菌落计数法，对我校女生宿舍2A320的管道自来水，圣王桶装水及校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水进行了菌落总数的测定，为全校师生的饮水安全提供理论和实践依据。

2. 材料与方法

2.1实验材料

随着生活水平的提高，人们对水的质量有了高要求，生产商择世所需，引进了先进的净水设备，来满足不同层次的人群需求。小区居民喝自来水，办公室人员喝桶装水，学生则喝瓶装水的居多，针对以上情况，本实验选取的水样是连云港师范高等专科学校女生宿舍2A320的管道自来水、圣王桶装水和校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎三种常见瓶装水。详情见表1。

表1 样品编号及存放时间

样品名称 管道自来水

圣王桶装水 康师傅 统 一 今麦郎

样品编号 ZS ST KS TS JS

实验日期 2010.11.15 2010.11.15 2010.11.15 2010.11.15 2010.11.15

存放时间(天） / 3 25 23 26

量取体积（ml）

15

15 15 15 15

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2.2培养基的配制及其灭菌

由于水中的细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖。因此本实验采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养出的细菌总数仅是一种近似值。本培养基的主要成分有：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，自来水[1]。

根据配置培养基的体积，事先加水溶解已经量取好的相应质量的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，然后加入到未沸的600-700ml的自来水中，边加热边用玻璃棒搅拌，待水沸腾后加入琼脂，再加水至1000ml，不断地搅拌直到液体呈半透明状将其取下，分装。分装好的培养基运用高压蒸汽灭菌，121℃，15min即可[2]。

2.3主要仪器

手提式高压灭菌锅（型号：YX280A）、超净工作台（型号：SW-CJ-1B）、恒温培养箱（型号：PYX-120）、显微镜（型号：OLYMPUS CH20）。

2.4染色液的制备

革兰氏染色实验需要的染色液有:草酸钙结晶紫、碘液、95%的乙醇、番红[3]。

草酸钙结晶紫的制备:先将2.0g结晶紫溶于20ml95%的酒精，0.8g的草酸铵溶于80ml蒸馏水中，然后将两液混合，静置48小时使用。

碘液的制备:先将1.0g碘与2.0g碘化钾混合，加水少许，略加摇动，待碘完全溶解后再加蒸馏水定容至300ml。

95%的乙醇的制备:将95ml的乙醇溶入100ml的水中。

番红的制备:将0.25g沙黄溶解于10ml95%的乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至100ml。

2.5菌落总数的测定

采用国标中规定的平板菌落计数法，详细步骤见下。

2.5.1水样的采取

自来水，先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，待用。

桶装水，取未打开的桶装水，打开盖子倒入灭菌的锥形瓶中，待用。

瓶装水，在超净工作台上打开盖子将水倒入灭过菌的锥形瓶中，待用。

2.5.2水样稀释及培养

2.5.2.1水样稀释 取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。管道自来水、圣王桶装水和三种瓶装水分别按照以上叙述进行稀释。通过预实验，本实验所采用的管道自来水的水样稀释度为100，圣王桶装水的水样稀

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释度为10-1，康师傅、统一、今麦郎三种瓶装水的水样稀释度均为100[4]。

2.5.2.2制作平板 用一支灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中,共做两个平皿。另取一支灭菌吸管吸取1ml灭菌的蒸馏水，注入灭菌培养皿中，共做两个皿，作为空白对照。分别在以上四个培养皿中倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。管道自来水、圣王桶装水和三种瓶装水分别按照以上叙述进行制作平板。每个水样两个平行样，共做十个平板，外加每个水样一个空白对照板。

2.5.2.3菌落培养 待培养基凝固后，倒置于37℃ 恒温培养箱中，培养48h。

2.6革兰氏染色 本实验采用革兰氏染色法对细菌菌落进行染色，革兰氏染色一般包括初染、媒染、脱色、复染、镜检五个步骤，染色制片后选用OLYMPUS CH20显微镜，在油镜下进行镜检。具体操作方法如下[5]。

2.6.1涂片固定 在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。

2.6.2初染 草酸铵结晶紫染2分钟，自来水冲洗，去掉浮色。

2.6.3媒染 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

2.6.4脱色 用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

2.6.5复染 用蕃红染液复染2分钟，水洗。

2.6.6镜检 干燥后用油镜观察，革兰氏阳性菌仍呈蓝紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。以分散开的细菌革兰染色反应为准，过于密集的细菌常由于脱色不完全而呈假阳性。

3结果

3.1平板菌落计数的结果

用直接计数法，记录每个水样每个平板的菌落数，然后计算每个水样同一稀释度的两 个平板的平均菌落数。

本实验管道自来水水样中的平均菌落数为66，且两个平行样间的菌落数相差小于5%；圣王桶装水水样中的平均菌落数为52，且两个平行样间的菌落数相差小于5%；康师傅、统一、今麦郎瓶装水的水样中的平均菌落数分别为0.5、1、1,且两个平行样间的菌落数相差均小于5%，详细结果见表2。

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表2 水样中菌落计数的结果

样品编号 CK CS1菌落数 CS2菌落数 平均菌落数

ZS

ST

KS

TS

JS 0 0 0 0 0 68 53 0 1 1

64 51 1 1 1 66 52 0.5 1 1

3.2水样中菌落总数（cfu/ml）的计算

因为本实验只有一个稀释度，所以计算公式为：N=∑C/2×d

公式中：

N——样品中菌落数

∑C——平板中菌落数之和

d——稀释度

3.2.1管道自来水菌落总数的计算 本实验采用的管道自来水的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是68和64,代入公式N=（68+64）/2,N=66。即管道自来水的菌落总数为66cfu/ml。

3.2.2圣王桶装水菌落总数的计算 本实验采用的圣王桶装水的稀释度为10-1，两个平行样的菌落数分别是53和51,代入公式N=（53+51）/2×10,N=520。即圣王桶装水的菌落总数为520cfu/ml。

3.2.3康师傅菌落总数的计算 本实验采用的康师傅的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是0和1，代入公式，康师傅N=（0+1）/2,N=0.5。即康师傅的菌落总数为0.5cfu/ml。

3.2.4统一菌落总数的计算 本实验采用的统一的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是1和1，代入公式，统一N=（1+1）/2,N=1。即统一的菌落总数为1cfu/ml。

3.2.5今麦郎菌落总数的计算 本实验采用的今麦郎的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是1和1，代入公式，今麦郎N=（1+1）/2,N=1。即今麦郎的菌落总数为1cfu/ml。

3.3革兰氏染色结果

管道自来水平板中的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察，细菌形态有短杆、梭状、长杆，且分别被染成红色、蓝紫色、蓝紫色；圣王桶装水平板中的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察，细菌形态有短杆、梭状、长杆，且分别被染成红色、蓝紫色、蓝紫色；三种瓶装水平板中的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察，细菌形态有短杆、梭状、长杆，且分别被染成红色、蓝紫色、蓝紫色。详情见表3。

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表3 革兰氏染色结果

革兰氏染色

细胞形态

颜色

短杆

梭状

长杆 红色 蓝紫色 蓝紫色

结果判断 革兰氏阴性 革兰氏阳性 革兰氏阳性

4.讨论

对照生活饮用水国标GB 5749-85中规定菌落总数不超过100cfu/ml，桶装引用水国标GB 19298-2003中规定菌落总数不超过50cfu/ml和瓶装饮用矿泉水GB l0789-89国标中规定菌落总数不超过20cfu/ml。本实验数据显示：连云港师范高等专科学校女生宿舍楼2A320的管道自来水的菌落总数为66cfu/ml符合国家标准；但是圣王桶装水的菌落总数为520cfu/ml,远超过了国标规定，污染较严重；校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水的菌落总数分别为0.5cfu/ml,1cfu/ml,1cfu/ml，均符合国家标准。

圣王桶装水中的菌落总数超标的可能原因分析如下：水生产出来后放置时间有些长，会滋生很多细菌；水在生产过程中净化装置没有及时更新；由于条件的限制，取样时水样受到污染；桶内壁没有彻底消毒、杀菌等。本次实验测定的桶装水是刚刚打开盖子的，其细菌总数已超标，随着饮用时间的推移，水中细菌数将不断增长，饮用后对人体的危害较大，针对以上情况，为了确保饮水安全，首先我们应该尽早饮用（夏天最好三天内，冬天一周内），其次，把水烧开后再饮用。桶装水、瓶装水对人体可能存在有不确定的危害因素，饮用管道自来水相比较安全。

本实验通过对水样中菌落总数的计算，简单的判断了水样中的菌落总数是否符合国家标准，并对培养基生长的微生物进行了革兰氏染色。然而水样中的微生物种类（如大肠杆菌）的检测还有待于将来做进一步分析。

参考文献

[1] 庞俊兰.细胞工程[M].高等教育出版社,2007-06-01,第1版 .

[2] 赵玉娥.生物化学[M].化学工业出版社,2005-06-01,第1版.

[3] 叶磊,杨学敏.微生物检测技术[M].化学工业出版社,2009-05,第1版.

[4] 丁兴华.食品检验工[M].机械工业出版社,2006-05-01第1版.

[5] 黄秀梨,辛明秀.微生物学实验指导[M].高等教育出版社,2008-01,第2版.

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致谢

经过半年的忙碌和工作，毕业论文设计已经接近尾声，作为一个专科生的毕业论文，由于专业知识的学习较浅显和实验操作能力较差，实验过程中难免有许多考虑不周全的地方，如果没有导师的督促指导，以及一起工作的同学们的支持，想要完成这个设计是难以想象的。

为了圆满完成这次实验，我跟另外两个同学一起准备实验用具，去查资料，讨论问题，实验一遍遍的重复，在天气寒冷的情况下，不想做实验的念头时时出现在脑海，时间又不是很充足，但是我们互相鼓励坚持了下来。由于时间和实验室的条件限制，我不能继续这个实验再做一些检测实验，但我要感谢系科免费为学生论文实验提供了药品和设备。通过这个实验，让我懂得团队合作的重要性，只有大家齐心，不怕困难，不去计较才能克服一切困难，为我以后的工作和生活打下了基础。 在论文写作过程中，得到了沈洁老师的亲切关怀和耐心的指导。她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到项目的最终完成，沈老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在此向沈老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。论文写作的过程并不轻松，学习的压力时时袭扰，知识的积累尚欠火候，于是，我一次次埋头于图书馆中，一次次在深夜奋笔疾书。第一次花费如此长的时间和如此多的精力，其中的艰辛与困难难以诉说，但曲终幕落后留下的滋味，值得我一生慢慢品尝。敲完最后一个字符，重新从头细细阅读早已不陌生的文字，我感触颇多。虽然其中没有什么值得特别炫耀的成果，但对我而言，是宝贵的。它是无数教诲、关爱和帮助的结果。

从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们!最后我还要感谢生命科学系和我的母校连云港师专三年来对我的栽培！