仪 器 分 析 实 验 报 告

实  习  名  称：      液相色谱分析实验      

学          院：       化学工程学院         

专          业：       化学工程与工艺        

班          级：       化工班            

姓          名：   学  号 

指  导  教  师：                      

日          期：            

一、实验目的                       

1、了解液相色谱的构造、原理及操作技术；

2、了解并熟悉液相色谱仪的流程及操作方法。

二．实验原理

   液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

   高效液相色谱分析的流程。由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

    高效液相色谱的分离过程。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

    开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

    不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

三．仪器及试剂

 仪器：液相色谱仪（大连依利特）、微量注射器

 试剂；乙腈和0.1%磷酸水溶液1:1混合液、样品（氨基布洛芬）

四．操作流程或步骤

1、准备(老师已备好)

(1)   准备所需的流动相，用合适的滤膜过滤，超声脱气；

(2)   根据待检样品的需要选择并安装好合适的色谱柱；

(3)   配置样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的滤膜过滤；

(4)   检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常；

(5)   开机：接通电源，依次开启不间断电源、泵、检测器，和检测器自检后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。

(6)   用样品液润洗注射器，润洗干净后，取20µL标准液，注入贮液器，观察电脑上峰的形成。

(7)   用润洗液润洗注射器，润洗干净后，取20µL样品也，注入贮液器，观察电脑上峰的形成，一次方法测量多组。

(8)   实验完成后，清理实验仪器，关闭相应仪器，最后关闭电源。

2、参数设定

（1）波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键,用数字键输入波长值，按[enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕，也可以选择LC-solution 软件方便地设定；

(2)流速设定：在泵显示初始屏幕时，按[func]键,用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1mL/min），按[enter]键确认。按[CE]键退出，也可以选择LC-solution 软件设定；

(3)流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键,用数字键输入流动相B的浓度百分数，按[enter]键确认。按[CE]键退出，也可在软件中设定。

3、更换流动相并排气泡

    将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中，逆时针转动A/B泵的排液阀180o，打开排液阀，按A/B泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9mL/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止，将排液阀顺时针转到底，关闭排液阀，如管路中有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。

4、平衡系统 

(1)   按 泵的[pump]键，亮pump指示灯。用检验方法规定的 流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相， 观测泵控制屏幕上的压力值， 压力波动应不超过1MPa。 

(2)   观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为<0.001mV时，可 认为系统已达到平衡系统，可以进样。

(3)   进样：将样品用滤膜过滤，用10uL玻璃注射器将样品液体从进样阀进（注意，进样时，尽量不要让针头接触进样孔的壁），进好样后，进行测试，观察工作电脑桌面上液相曲线变化，测试完后停止进样，用电脑进行数据分析。

5、关机 实验完毕后，关闭仪器和电脑。

五．实验参数

 见附页

六．实验结论

1.已知液相关数据的计算

1）理论塔板数的计算

如图取第3组、第8组得

峰高的平均值

峰面积平均值A=(1825.31+1758.64)/2=1791.975

如图取第3组数据，

保留时间：

2）分离度的计算

取数据第2组，第3组数据

取第3组，第4组数据

取：R=1.5作为相邻两峰完全分离的标准。即可得到如下结论：

，可认为完全分离。

，可认为完全分离。

2.未知液相关数据的计算

  取第12组、16组、20组数据

  峰高平均值

  峰面积平均值A=(170.84+174.42+176.54)/3=173.93

1）理论塔板数的计算

同上代入第16组数据，如下

2）分离度的计算

取第15、16组数据：

取数据第16、17组数据

，可认为完全分离。

，可认为完全分离。

七．结论

    标准液峰分别是出现在2.97750min的第3个峰、出现在9.34500min的第8个峰；三次样品峰分别是出现在15.49583min的第12个峰、出现在20.46667min的第16个峰和出现在26.50883min的第20个峰。

由于实验组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用外标法作为定量的方法。

最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用甲醇溶液润洗干净，以免相互影响。

八．注意事项

(1)   流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他      物质 。

(2)   使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子，然 后用  甲醇(或甲醇水溶液)冲洗，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml左右。

(3)   每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

(4)   气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

(5)   如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动      相的清洗。

(6) 更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新      的流动相中。

九．问题讨论

    影响柱效能的主要因素有：填料、柱压、温度、流速。于是在实验过程中要注意仪器在运行中不能进入气体，否则会导致压力不稳定，影响柱效。

色谱柱标明了流体的流动方向，不要改变其流动方向，否则会降低色谱柱的性能。

为什么不能用纯乙腈作为流动相？因为这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

 

第二篇：实验报告-高效液相色谱法测定VE含量

实验四高效液相色谱法测定V_E含量

1 实验目的

1.1  了解高效液相色谱仪的基本操作；

1.2  了解高效液相色谱仪测定V_E的原理。

2 实验原理

高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

V_E（维生素E）又名生育酚或产妊酚，在食油、水果、蔬菜及粮食中均存在。有抗氧化作用，能增强皮肤毛细血管抵抗力，并维持正常通透性；有改善血液循环及调整生育功能、抗衰老作用等。V_E通过高效液相色谱柱进行分离，PDA检测器检测，外标法定量。

3实验器材

3.1 实验样品

V_E样品溶液

3.2 实验试剂

浓度为50µg/ml的V_E标样

3.3 实验仪器

高效液相色谱仪附PDA检测器

4 色谱条件

色谱柱：C₁₈柱；   流动相速度：0.3ml/min；

进样量：5µl；     柱温：30℃。

5 实验结果与讨论

5.1  实验结果

本次实验采用的是单点法测定。实验结果见表1。

表1. 液相色谱仪测定苹果的VE含量

样品中VE的浓度=乙烯标样的总量×苹果的峰面积/乙烯标样的峰面积

=5µl×50μg/mL×17369/（5µl×42217）=20.57μg/mL

5.2  实验讨论

本次实验中，测定标样溶液V_E含量时，在指定的保留时间内并未出峰。讨论分析原因：样品溶液在上周实验后，一直置于离心管中，未避光低温保存，导致样品中V_E氧化，液相测定时没有在相应的时间出峰。本次实验时间较短，且主要目的是了解高效液相色谱仪的基本操作，以及液相色谱仪测定V_E的原理，故结合前组同学对V_E含量的测定数据进行讨论与分析。

因时间有限，实验采用了单点法进行测量分析，且无平行重复，这样误差较大。我们以后实验时，V_E标样可以选择5个浓度，每个浓度分别测定3-4次，取其峰面积的平均值后作标准曲线，这样误差更小。

6知识扩展

6.1  高效液相色谱仪包括哪几个部分组成？

答：高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测器这四个部分组成，其流程图见图1。

输液系统包括贮液槽和输液管道、高压泵和梯度洗脱装置。贮液槽，通常是由玻璃或不锈钢等材料制成的，用来存贮足够数量、符合分析要求流动相的容器。输液管道是管道内径很小的用于连接高效液相色谱仪各主要流路系统。高压泵是将流动相在高压下连续送入色谱柱，使样品在色谱柱内完成分离过程。高效液相色谱仪采用的是往复式恒流泵，是具有输出压力高、流量稳定、流量可调范围宽、泵内死体积小、具有梯度洗脱及耐酸碱腐蚀、溶剂更换迅速等性能。梯度洗脱装置是在分离过程中，随时间函数程序改变流动相组成，有分低压梯度和高压梯度

两种装置。

图1 高效液相色仪流程图

进样系统有由进样口、注射器、流通阀和定量管等组成，其作用是使样品有效地送入色谱柱。进样系统是柱外效应的重要来源之一，为了减少对柱高的影响，避免由柱外效应而引起峰展宽。进样口要求死体积小，这样能使样品各组分几乎同时进入色谱柱。

色谱分离系统由色谱柱、柱恒温器组成。色谱柱由柱管和固定相构成，分为普通分析柱（内径大约4~5mm）、半制备或制备柱（内径大于8mm）、窄柱（内径在2mm左右）以及微径柱（内径小于1mm），内径小的色谱柱相对更省溶剂，相对灵敏度更高。柱恒温箱是另一个重要的组成，柱温是液相色谱的重要操作参数。高精度的温度控制对保证色谱柱性能，进行高精度、高重现性的分析是比不可少的。

高效液相色谱仪的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、示差折光检测器和二极管阵列检测器。

6.2  操作高效液相色谱仪时需要注意哪些问题？

答：操作高效液相色谱仪时应注意：

1）配置样品时要严格按照标准配制对照品浓度（低浓度），不可超过或低于一倍。

2）所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。

3）实验前要检查仪器是否存在漏液现象、压力是否稳定、柱子是否安反。检查完毕后，打开电脑、工作站电源开关后，再打开泵电源开关、控制面板上泵开关。先用色谱甲醇冲洗柱子，等待机器平稳后，再打开检测器电源开关、控制面板上检测器开关。30分钟后方可进针做实验。

4）对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数）。

5）注意系统评价：理论板数（达到标准要求）、分离度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之间）。

6）平行进针要求RSD<2％，进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。

7）操作过程中，应注意机器异常情况的发生（声音），压力是否过高（超过200Bar不可再做实验），流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。

8）实验结束后，用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水冲洗0.5小时，再用甲醇冲洗一小时。

9）由于实验时间加长，导致对照品与样品保留时间不一致时，在实验最后加进一针对照品，或采用对照品加样品同时进样的叠加法进样，对照峰面积是否为两者之和。

6.3 简述高效液相色谱仪常用的检测器及其特点。

答：高效液相色谱仪常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、示差折光检测器和二极管阵列检测器。其具有：①灵敏度高；②对各类组分化合物都有响应或有特殊的选择性；③线性范围宽；④死体积小；⑤不破坏样品；⑥性能稳定，对温度和流速的变化不敏感；⑦能连续工作，可靠方便。

紫外-可见光检测器是高效液相色谱中应用最广的的检测器，它对许多样品具有高的灵敏度，最小检测量可达10-9g。

荧光检测器是选择性检测器，用于测定能发出荧光的物质。

示差折光检测器是通用型检测器，其利用纯流动相与含有被测组分的流动相之间折射率的差别进行检测。凡具有与流动相折射率不同的组分，均可适用这种检测器。

二极管阵列检测器是一种新型检测器相当于紫外-可见光检测器，进入流动池的不是单色光，得到的信号是在所有波长上的三维色谱光谱信号。用以判别色谱分离的状况及强化定量和定性分析。

6.4高效液相色谱的应用——氨基酸分析

答：氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之一。多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，示差折射检测器对氨基酸也无足够的灵敏度，为提高分析灵敏度和分离选择性，需氨基衍生，衍生的方式有柱前衍生和柱后衍生。因此，反相高效液相色谱法与各种柱前衍生相结合的氨基酸分析技术，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术

柱后衍生离子交换色谱仪具备很高的自动化水平，分离氨基酸在特有柱后氧化及衍生中按固定程序与衍生试剂迅速反应并检测，消除由衍生时间、温度等因素的差异带来的测试误差。衍生试剂不直接进入色谱柱使柱寿命延长，同时还可再生延长离子交换树脂固定相的使用时间。

衍生中最常用的是茚三酮柱后衍生法，这种方法几乎能分析所有氨基酸和氨基酸衍生物，蛋白质水解氨基酸之间不存在明显的衍生后灵敏度变化，该法分析技术手段繁多，对样品中存在的杂质适应性好，不足是分析周期时间长。柱前衍生反相分配色谱分析法突出的优点是灵敏度高，分析时间短。