分析实验报告高效液相色谱

华南师范大学实验报告

学生姓名：## 学号：

专业：化学年级班级：08化二

课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯

实验类型：综合实验时间：20##/416

实验指导老师曹立娟老师实验评分：

一、[实验目的:]

1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法

2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术

二、[实验原理:]

高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。

其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、[仪器和试剂:]

1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；

10μL微量注射器

2、试剂：

甲醇、水

苯和甲苯混合待测溶液

苯标准溶液：2.0μL/mL

甲苯标准溶液：2.0μL/mL

苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL

四、[实验步骤]

1、按操作规程开机。

2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件

通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。

调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min。柱温30℃，检测波长354nm

3、苯、甲苯定性分析

在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样10μL苯和甲苯混合待测溶液，10μL苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。

4、苯、甲苯定量分析

在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL 10.0μL/mL的苯和甲苯混合标准溶液10μL。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线

5、苯和甲苯混合待测溶液分析

根据得到的苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。

六、实验数据处理及分析

1、色谱条件优化

分析：本次实验分别选择了甲醇：水=60%：40%，70%：30%，80%：20%的溶剂配比，通过比较不同溶剂配比条件下，甲苯和苯的峰宽、保留时间从而确定采用甲醇：水=80%：20%作为本次实验的最佳色谱条件。

2、定性分析

分析：在同一色谱操作条件和进样量下，分别测定试样溶液中苯和甲苯组分及已知苯和甲苯纯物质的保留时间，并将其色谱峰、保留时间与对应的已知苯和甲苯纯物质进行比较，两者基本相同，从而确定混合样品中含有苯和甲苯。

3、定量分析

苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。

4、未知样品浓度

七、结果讨论

1、实验中为什么采用标准曲线法作为定量的方法？

答：因为实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单。只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作、计算复杂，不能快速分析，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。

2．在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

3．选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

4．影响分离的因素与提高柱效的途径

1）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径，降低固定相粒度可提高柱效。

2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温）

3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。

5.高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：
(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；
(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；
(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；
(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；
(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；
(6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。

6．高效液相色谱的定性和定量分析的方法

定性：①利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

②利用文献保留值定性

相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

定量：有归一法、内标法、外标法

在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。

第二篇：乳制品中三聚氰胺的含量的测定(高效液相色谱法)实验报告

20##级化学教育仪器化学综合性与设计性实验

指导老师：曹** 20##年 5月 30号

一、实验目的

1．通过分析化学综合性实验、设计性实验，培养学生初步的解决分析化学实际问题的能力，培养学生的创新意识与创新能力。

2．学习查阅参考文献、综合参考资料、设计小型分析化学实验。

3．复习和巩固有关理论基础知识并用于指导实践。

4．进一步熟练掌握实验操作技术。

① 实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）

② 摘要、关键词：

[摘要] 为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取, 离子交换萃取小柱净化, 结合高效液相色谱进行样品测定。色谱条件: A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。

色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm），检测波长：239 nm

结果表明: 三聚氰胺标准曲线为y = 4495951 x +18978.83 , 相关系数R = 0.9999693, 在0.17～110.0 mg/L范围内线性关系良好, 方法检出限为0.12 mg/L, 两个样品三个水平的加标回收率分别为96.34 % (RSD = 4.76)、84.86 % (RSD = 7.21) 、104.29 % (RSD = 7.63) 和95.31 % (RSD = 4.39) 、89.25 % (RSD = 3.88) 、92.59 % (RSD = 5.27)。

[关键词] 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品

③ 引言

一、目前有关三聚氰胺在乳制品中的概述：

三聚氰胺(melamine) ）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种重要的氮杂环有机化工原料, 通常用于塑料制品中合成树脂的生产[ 1 ] 。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶於丙酮、醚类、对身体有害，不可用於食品加工或食品添加物。

由于中国采用估测食品和饲料工业蛋白质含量方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被作假的人称为“蛋白精”。　　蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16％左右，而三聚氰胺的含氮量为66％左右。常用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺杂后不易被发现。　　

奶粉事件：近年来, 一些不法厂商将三聚氰胺添加到奶粉中, 以增加蛋白质含量。 20##年9月, 震惊中外的“三鹿婴幼儿奶粉事件”[ 2 ]暴露出乳制品行业的“潜规则”, 国内一些知名乳品品牌也被检出其产品中含三聚氰胺[ 3 ] 。各个品牌奶粉中蛋白质含量为15-20%（晚上在超市看到包装上还有标示为10-20%的），蛋白质中含氮量平均为16%。某合格奶粉蛋白质含量为18%计算，含氮量为2.88%。而三聚氰胺含氮量为66.6%，是鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质。　　

微溶系指1g(ml)溶质能在100ml～1000ml溶剂中溶解，三聚氰胺在水中微溶，在牛奶这种水包油型的乳液中溶解度未找到实验数据，应该比水的溶解度要好一些，待验证。　　

检测方案：在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测目前并无国家标准。因此，德国莱茵TÜV集团参照美国食品化学品法典(FCC)HPLC-UV定量方法，同时还可采用HPLC/MS检测方法（实验室方法）对婴儿食品，宠物食品，饲料及其原料(包括淀粉，大米蛋白, 玉米蛋白, 谷朊粉、粮油等)开展的检测业务，检测结果具备权威性。

因此, 如何快速、准确分析乳制品中的三聚氰胺成为多方关注的问题. 本次设计性实验在NY/T 1372—2007标准[ 4 ]的基础上进行改进, 结合其他产品中三聚氰胺的测定方法[ 5 ] , 利用高效液相色谱法对乳制品进行三聚氰胺含量的测定。

二、对三聚氰胺的测定方法概述：

国家质量监督检验检疫总局与标准化管理委员会联合发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，即国标GB/T22388-2008。这一新标准制定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法及气相色谱-质谱联用法三种检测方法与标准。三聚氰胺的检测方法还包括试剂盒检测法（ELISA）、离子交换色谱-紫外检测法等。

1、高效液相色谱法（HPLC)：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。在添加浓度2mg/kg～10mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。

2、气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）：试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。其中GC-MS法在添加浓度0.05mg/kg～2mg/kg浓度范围内，回收率在70%～110%之间，相对标准偏差小于10%；GC-MS/MS法在添加浓度0.005mg/kg～1mg/kg浓度范围内，回收率在90%～105%之间，相对标准偏差小于10%。3、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）：试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。在添加浓度0.01mg/kg～0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。

4、试剂盒检测法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA）：试剂盒检测法即为酶联免疫吸附剂测定，是利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定的一种方法。

5、离子交换色谱-紫外检测法：何强建立离子交换色谱-紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品用水和乙腈提取，分析时用LC-SCX离子交换色谱柱分离，浓度为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0）-乙腈（70：30）为流动相，在紫外波长240nm处检测。三聚氰胺为0.5mg/L-100.0mg/L时，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），最低检出限为1.0mg/kg，加标回收率为93.8%～102.5%，RSD＜3.5%。

6、其他检测法：利用抗原与抗体相互识别的原理，制作出能识别三聚氰胺的抗体试纸，将试纸插入稀释的奶制品中，则可检测出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分离技术萃取样品溶液，然后采用紫外可见光度法或化学检验的方法检测样品中三聚氰胺的含量。

三、选定实验方案的原理：

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，（其中包括试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液），再经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。

三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：a)可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。　　b)批次重复性好。　　c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

④ 实验部分

一、所使用的仪器和试剂：

仪器：1200高效液相色谱仪 ;分析天平；小烧杯；玻璃棒；容量瓶（100ml、25ml）；胶头滴管；量筒（10ml、25ml）；具塞刻度试管（50ml）；超声波提取仪；离心管（10ml）；离心机;有机滤膜；微量注射器；

试剂：三聚氰胺标准品( Sigma) ; 三氯乙酸、乙腈、(分析纯, ) ;实验用水为去离子水；待测乳制品（伊利奶粉）。

二、实验步骤：

1、　样品的制备

参照NY/T 1372—2007标准的方法[ 4 ] , 准确称取伊利奶粉5.0g四份, 其中一份加入到具塞刻度试管后，再加入1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈溶液5 mL, 超声提取10 min后, 用三氯乙酸定容至刻度，混匀。静置,将其转移至离心管，于30 000 r/min下离心10 min, 取离心后的上清液10 mL, 转移至25ml的容量瓶中配成25ml的溶液，再转移少量溶液备用用于下次待测。过0.45μm滤膜, 上机测定。

2、　标准溶液的配制以及标准曲线的制作（已做）

3、三聚氰胺的含量

根据绘制的标准曲线计算待测乳制品中三聚氰胺的含量，并使用有关软件计算出其他有关的数据，再通过数据分析实验，讨论并得出结论。

5 结果与讨论

（1）实验数据结果与处理

高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量

色谱条件：

A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。

色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm），检测波长：239 nm

一、定性