华南师范大学实验报告

液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯

一、实验目的

1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法；                          

2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。

二、实验原理

高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、主要仪器和试剂

主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测器，Phenomenex ODS 柱]； 10μL微量注射器

试剂：苯标准溶液：10.0μL/mL ；                                               

甲苯标准溶液：10.0μL/mL；                                                   

苯、甲苯混合标准溶液：10.0μL/mL ；                                      

甲醇：80% ；                                                        

苯和甲苯混合待测溶液；

四、实验步骤

1、标准溶液的配制系列

用100μL的微量注射器分别量取10μL、20μL、 50μL 、100μL的苯和甲苯的混合标准溶液（10.0μL/mL），再分别加入90μL、80μL、50μL 、0μL甲醇将其稀释，作为待测液，其浓度分别为1μL/mL 、2μL/mL 、5μL/mL 、10μL/mL

2、色谱条件优化

①按操作规程开机，并调好色谱条件，使仪器处于工作状态。控制流动相流速为甲醇：0.8mL/min、水：0.2 mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。

②改变色谱条件，控制流动相流速为甲醇：0.95mL/min、水：0.05 mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。

③通过观察两种色谱条件下的峰分离效果，选择最佳的色谱条件。若还不能达到最佳的分离效果，可以再设定不同的色谱条件，然后根据峰分离效果，选择最佳的色谱条件。

3、苯、甲苯定性分析

在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样5μL苯和甲苯混合待测溶液，5μL苯标准溶液（10.0μL/mL）和5μL甲苯标准溶液（10.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。

4、苯、甲苯定量分析  

   最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样1.0μL/mL 、2.0μL/mL、4.0μL/mL、10.0μL/mL的苯和甲苯混合标准溶液5μL。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线。

5、苯和甲苯混合待测溶液分析

  最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器进样苯和甲苯混合待测液5μL，观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。根据峰面积在工作曲线上查出苯和甲苯待测液的浓度，并计算试样中苯和甲苯的含量。

五、实验数据及分析

高效液相色谱数据报告

一、色谱条件优化

二、定性分析

三、   定量分析

苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。

四、   未知样品浓度

六、   实验讨论

①由于实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果，因而采用标准曲线法。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。

②最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。若苯与甲苯的峰分离效果过小，苯与甲苯的峰未能完全分离，必定影响其保留时间和峰面积的计算，是实验准确度减小，数据误差加大；若苯与甲苯的峰分离效果过好，虽然能将苯与甲苯的峰完全分离，实验准确度好，但是耗费的实验时间较长，效率不好。因而，应选择合适的色谱条件。

③为了提高标准曲线的拟合度，可以重复进样多次，并且由同一人进样，以免因个体习惯不同引起实验误差。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用乙醇溶液润洗干净，以免相互影响。

 

第二篇：研究生液相色谱实验报告

高效液相实验报告

实验目的

1.      了解高效液相色谱仪的类型和各自的优缺点;

2.      了解液相色谱仪及各检测器的工作原理

3.      掌握高效液相色谱仪的操作;

4.      .学会高效液相实验数据的处理;

实验原理:

1. 液固色谱法　使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2. 液液色谱法　使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动正相色谱法　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
    反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

3. 离子交换色谱法　固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

4. 离子对色谱法  根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

5. 排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

实验设备：高效液相色谱仪

仪器及试剂：邻硝基苯酚 间苯三酚 注射器

实验步骤及数据处理：

1.  实验前提前打开仪器进行平衡；

2.  将待测样品脱气及过滤处理；

3.  本实验用邻硝基苯酚和间苯三酚不同浓度的混合液做标准曲线得到的标准曲线图

4.  根据标准曲线进行定性实验测得第一个峰为间苯三酚，含量为0.063mg/ml第二峰为邻硝基苯酚；浓度为0.074mg/ml.