仪器分析实验报告

 

实  验  名  称：      液相色谱分析实验        

学         院：        化学工程学院           

专          业：       化学工程与工艺         

班          级：       化工113班             

姓          名：  学  号

指  导  教  师：          张侃                

日          期：      2014年5月6日         

一、实验目的

1. 了解HPLC的结构，了解仪器的开、关程序；

2. 了解流动相的制备和样品溶液的制备；

3. 掌握外标法计算浓度的方法。

二、实验原理

液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，试剂瓶中的流动相被泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

    高效液相色谱分析的流程。由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

    高效液相色谱的分离过程。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

三、仪器与试剂

仪器：液相色谱仪（大连依利特）、10μL的微量注射器。

试剂：乙腈和重蒸水溶液6:4混合液、2,2-双[4-（4-氨基苯氧基）苯基]丙烷（BAPP）

四、实验步骤

1.   流动相的准备

  准备所需的流动相乙腈和重蒸水，将其分别用有机滤膜和水膜过滤，再以6:4的比例混溶，然后超声脱气。

2.   开机，色谱柱平衡

   当步骤1完成后，开机，待色谱柱平衡。

3.   样品溶液的准备

  取合适计量的样品(如取50mg的BAPP溶于50mL的水中)，在重蒸水里溶解，最后用容量瓶里定溶，最后用有机滤膜过滤，把它注入子弹头里。

4.   基线的查看

由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。

5.   样品进样分析

用25mL的微量注射器取5mL的BAPP溶液，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入注射器的孔时，打开微量注射器阀，将BAPP注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。

6.   色谱柱的清洗

分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用适当的液体来清洗色谱柱。

7.   关机

  实验完毕后，关闭仪器和电脑。

五、实验数据

Y=701.393x+14.513

峰高与浓度的关系图

 

Y=30830.8x-796.07

                         峰面积与浓度的关系图

    由上图可得以下结论：

    该样品的主峰出现在12.983min，在此之前与之后分别存在杂质峰。主峰的峰宽为0.3326min，峰高为1619.79114mAU，峰面积为93.3238×10⁴mAU*s。

查浓度与峰面积以及浓度与峰高关系图可以读出：当峰面积为9.33238×10⁴mAU*s时，浓度C=3.05mg/mL；当峰高为1619.79114mAU时，浓度C=2.29mg/mL。

综上所述，该未知液的浓度为2.29mg/mL。

六、实验结论与分析

由于实验组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用外标法作为定量的方法。 

最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用甲醇溶液润洗干净，以免相互影响。下面两幅图是标准溶液在不同浓度时峰面积图和峰高图。

由给定的数据关系可做峰高与浓度，峰面积与浓度的关系图，在根据所得的结果，在一下图上找点，如下：

由色谱图和实验结果可知，我们组该实验做的还是比较成功的。

但实验中还是应该注意以下几点：

 1.注意注射器的选择，应选用平头的注射器。

2.实验过程中要注意仪器在运行中不能进入气体，气泡会使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

 3.不能用纯乙腈等作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

 4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

 5.液相色谱柱应选择C-18反相色谱柱。

 6.使用缓冲溶液时，先用5%的乙腈和95%水冲洗，再用纯的乙腈清洗40分钟以充分洗去离子。

 7.流动相的浓度不可以太高。

 

第二篇：高效液相色谱分析实验讲义

高效液相色谱分析实验

一、实验目的

1． 了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作

2． 学习苯-甲苯混合物的定性分析方法

3． 评价色谱柱效

4． 了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；

5． 学习未知样品的定量分析方法。

二、实验原理

不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。

色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等

1．色谱定性分析方法

（1）利用保留值与已知物对照定性

A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）

2．色谱定量分析方法

⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。

⑵常见的色谱定量分析方法主要有：

a 归一化法。特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。

b内标法。特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。

c 标准曲线法（外标法）。简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。

d 内标标准曲线法。

三、仪器与试剂

LC-1000型高效液相色谱仪 P3000A-UV3000型高效液相色谱仪

甲醇(色谱纯) 二次去离子水 苯 甲苯 苯－甲苯

四、高效液相色谱仪操作步骤

1. 流动相的预处理

用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。

2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备

3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作

a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；

b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；

c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。

d 关闭三通阀，设置最小压力(0.1)和最大压力(20)，并设置实验需要的流速(0.8~1.1ml/min)，启动高压泵。

e 点击采集基线图标（或者在操作中选择采集基线），查看基线运行情况，待运行平稳后，在控制面板窗口中，点击归零，使基线置于零；点击停止采集(此时高压泵正常运行)

f 用平头微量注射器洗涤进样口后，取试液20 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时注入样品，转动阀柄至“Inject”位置，此时软件自动进入“采集数据”模式。

注意！平头微量注射器用甲醇清洗3次后，再用试液清洗3次，避免气泡。

h 待所有色谱峰流出完毕后，按“停止采集”键，保存数据在D盘/仪分实验。

i 点击谱图处理中的定量结果，记录组分的保留时间以及峰面积、峰高等色谱信息。

注意！注射器进不同样品前，使用专用清洗注射器在进样阀的“Load”和“Inject”位置，用流动相清洗几次。

4. LC-1000型高效液相色谱仪操作

a. 依次打开高压输液泵、紫外检测器电源开关；

b. 打开色谱N2000在线工作站，选择通道，建立运行方法；

c. 打开三通阀(逆时针半圈)，按“Purge”排除流路中的气泡。排气完毕后，按“Stop”键，停泵，关闭三通阀。按“Flow”设置流速1.0 mL/min，“Enter”确认。按“Pmax”和“Pmin”设定压力。

d. 按“设定”键，检测波长254 nm。按“↓”键，输入“1”，开启氘灯。

e. 按“Run”键，启动输液泵。

f. 检查基线，零点校正，基线稳定后，用平头微量注射器取试液20 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时注入样品，转动阀柄至“Inject”位置，同时点击软件“采集数据”。 注意！平头微量注射器用甲醇清洗3次后，再用试液清洗3次，避免气泡。

g. 待所有色谱峰流出完毕后，按“停止采集”键，保存数据在D盘/仪分实验。

h. 打开N2000离线工作站，调用数据文件(D/仪分实验)，不覆盖当前工作(No)。查看保留时间，峰面积，理论塔板数，分离度等参数。预览、打印图谱和分析结果。

注意！注射器进不同样品前，使用专用清洗注射器在进样阀的“Load”和“Inject”位置，用流动相清洗几次。

5. 结束工作

所有样品分析完毕后，流动相继续流动10～20 min，至基线稳定。关闭检测器，按“Stop”停泵。关闭泵电源。

五、实验内容

1. 分别进样苯、甲苯标样和苯-甲苯混合试样，保留时间定性，记录苯-甲苯混合试样色谱谱。

2. a. 分别采集系列甲苯溶液以及未知试样的色谱图，根据保留时间定性，确定甲苯组分峰的位置，并测定各自的峰面积。 b. 根据实验数据，利用外标法绘制标准工作曲线，并计算待测溶液中甲苯的含量。

3. (选做). 改变体系的流速(0.8、1.0、1.2ml/min)，进苯-甲苯混合溶液，记录两组分的保留时间、峰宽以及分离度与流速之间的关系，并结合色谱的原理，简要探讨其原因。

六、思考题：

（1）若进样之后，没有样品峰出现，有哪些可能的原因？

（2）与气相色谱柱相比，为何液相色谱柱一般都很短？

（3）为了提高液相色谱的分离效果，可采取哪些有效措施？