细胞生物学实验报告5

湖南科技学院实验报告

学生姓名       李诗           学号   201107004215      

专    业       生物技术         年级、班级    1102      

课程名称     细胞生物学实验     实验指导老师    蒋琼凤、沈玉平

细胞中过氧化物酶的显示

细胞凋亡的形态学检测与观察

一、实验目的：

1. 掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。

2. 了解细胞凋亡的生物学意义

3. 掌握凋亡细胞的形态学检测方法

二、实验原理：

1.细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。

2．细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶

参与的过程。

3.凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体;根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。

三、实验步骤：

细胞中过氧化物酶的显示

1、在载片上滴一滴PBS缓冲液；

2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上；

3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；

4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。

5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）

6、清水冲洗，番红复染2min。

7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100×）  

细胞凋亡的形态学检测与观察

吉姆萨染色:

1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)

2、生理盐水轻轻漂洗细胞

3、95%乙醇固定5min

4、PBS缓冲液洗2次

5、吉姆萨染色液染色5min

6、蒸馏水轻轻洗去染液

7、普通光学显微镜下观察。

吖啶橙染色:

1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)

2、生理盐水轻轻漂洗细胞

3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min

4、PBS缓冲液洗2次每次1min

5、 0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min

6、蒸馏水轻轻洗去染液

6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。

四、结果与分析：

1、根据随机选择的几个视野的统计，该样品的细胞凋亡率=227/506×100﹪=44.9﹪


Hela细胞凋亡过程中核染色质              

的形态变化（吖啶橙染色）

五、思考题：

1、细胞凋亡的调控机制

细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程，其触发因素多种多样，包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。

2、细胞凋亡的特征

凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝

聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形

成大小不同的凋亡小体。

3、研究细胞凋亡的方法

定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）

定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。

 

第二篇：细胞生物学5

具有降解cyclinA和B的功能，G1期周期蛋白虽无破坏框，但是有一个PEST序列，可能与其不稳定性有关） 细胞周期中三个关键的过渡：G1期到S期、中期到后期、后期到末期及胞质分裂期的过渡，这些过程都是通过触发蛋白质降解进行的，所以都是不可逆转的，使细胞周期只能沿一个方向进行。 细胞周期调控系统的主要作用：在适当适合激活细胞周期各个时相的相关酶和蛋白，然后自身失活；确保每一时相事件的全部完成；对外界环境因子起反应 细胞周期中的三个主要关卡：G1关卡（关键，一个基因是所有真核细胞都具有的）、G2关卡（控制系统检测中细胞的大小状态，细胞内DNA复制是否完毕）、中期关卡（控制系统检测所有染色体是否都与纺锤体相连、是否都排列赤道板、MPF是否失活，否则不能进行有丝分裂和胞质分裂） 细胞周期的关卡和影响事件：DNA复制不完全（没有将所有的染色体都复制的细胞不能进入有丝分裂）；纺锤体装配不正常（秋水仙素的作用是一直微管的聚合，抑制有丝分裂纺锤体的装配，从而抑制细胞分裂）；DNA损伤（如果细胞中的DNA因UV、射线或化学修饰等引起的损伤，细胞也会被阻止在G1或G2期，直到受损伤的DNA被修复）

细胞的重要性：一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位 细胞是生命活动的基本单位：一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位；细胞具有独立的、有序的自控代谢体系；细胞是代谢与功能的基本单位；细胞是有机体生长与发育的基础；细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性；没有细胞就没有完整的生命。 细胞概念的新思考：细胞是多层次非线性的复杂结构体系；细胞是物质、能量与信息过程精巧结合的综合体（细胞完成各种化学反应，细胞需要和利用能量，细胞参与大量机械活动，细胞对刺激作出反应）；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。 细胞的基本共性：所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜；所有的细胞都含有两种核酸，作为遗传信息复制与转录的载体；作为蛋白质合成的机器，核糖体存在于一切细胞中；所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 原核细胞基本特点：遗传信息量小，遗传信息载体仅由一个环状DNA构成；细胞内没有分化以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核膜。 支原体：没有鞭毛、无活动能力，可以通过分裂法繁殖，也有进行出芽增殖的；目前发现的最小最简单的细胞。 原核细胞与真核细胞比较：没有核膜包围的典型的细胞核，核物质集中在核区，无染色体，有裸露的DNA；细胞质内高尔基体、线粒体、内质网、叶绿体，但有分散的核糖体；细胞膜的化学组成和结构与真核细胞相似；细胞壁的主要成分是肽聚糖；细胞较小。 真核细胞的基本结构体系：以脂质及蛋白 质成分为基础的生物膜结构系统；以核酸与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统；由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。 植物细胞与动物细胞比较：细胞壁、液泡、叶绿体、溶酶体、中心体 细胞质膜结构模型：蛋白质-脂类-蛋白质三夹板质膜结构模型；单位膜模型；镶嵌模型生物膜的流动；脂筏模型。 脂筏：膜中富含胆固醇和鞘磷脂的微区，其中聚集一些特点的蛋白质，这些区域比膜的其他部分厚，更有秩序且较少流动性。功能：信号转导、蛋白质转运 生物膜结构：磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分，尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白；蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，膜蛋白赋予生物膜功能的主要决定者；生物膜是磷脂双分子层嵌有蛋白质的二维流体。 膜脂：磷脂（50%，甘油磷脂和鞘磷脂；主要特征：有一个极性头和两个非极性尾、脂肪酸碳链碳原子数为偶数、有饱和和不饱和两种）+糖脂+胆固醇（细菌质膜不含） 膜脂的四种运动方式：沿膜平面的侧向运动，脂分子围绕轴心的自旋运动，脂分子尾部的摆动，双层脂分子之间的翻转运动，频率较小，但新合成的较高。 脂质体：脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。应用：研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质，脂质体中裹入DNA可用于基因转移，在临床治疗中，脂质体作为药物或酶等载体。 膜蛋白：基本类型—外周膜蛋白，水溶性的，靠离子键或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子 1

或脂分子极性头部共价结合，易分离。内在膜蛋白—水不溶性蛋白，形成跨膜螺旋，需要去垢剂使膜崩解后才能分离。脂质锚定蛋白—通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合

内在膜蛋白与脂质结合的方式：膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子疏水核心的相互作用；跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带负电的极性头形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过钙离子等阳离子与带负电的磷脂极性头相互作用；某些膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子，插入脂双层之间，进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力，还有少数蛋白与糖脂共价结合。 确定膜蛋白方向的实验：胰酶消化法、同位素标记法 生物膜结构特征：膜的流动性（膜脂的流动性—不饱和程度越高，膜脂流动性越大，稳定也影响；膜蛋白流动性—成斑现象或成帽现象）+膜的不对称性（细胞质膜脂双层中各种成分是不均匀分布的，包括种类和数量的不均匀）+膜的分相现象（生物膜含有流动性的脂质是可逆地进行从无序到有序的相变） 流动性意义：是生物膜正常功能的必要条件；酶活性与流动性有极大地关系，流动性大活性高；如果没有膜的流动性，细胞外的营养物就无法进入，细胞内合成的胞外物质及细胞废物也不能运动细胞外，这样细胞就要停止新城代谢而死亡；膜流动性与信息传递有着极大地关系；如果没有流动性，能量转换是不可能的；膜的流动性与发育和衰老过程都有相当大的关系。 不对称意义：细胞间的识别、运动、物质运输、信号传递等都具有方向性，这些方向性的维持就是靠分布不对称的膜蛋白、膜脂和膜糖来提供；膜不仅内外两侧的功能不同，分布的区域对功能也有影响，造成这种功能上的差异，主要是膜蛋白、膜脂和膜糖分布不对称引起的；糖脂位于脂双层外侧的信号或受体、磷脂酰肌醇主要集中在内叶，它们在将细胞质膜的刺激向细胞质传递中起关键作用 细胞质膜的功能：为细胞提供一个相对较稳定的内环境；选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；提供细胞识别位点，使酶促反应高效而有序地进行；介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。 膜骨架：指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网连架结构，它参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。 细胞连接的功能分类：封闭连接（紧密连接）、锚定连接、通讯连接（间隙连接、化学突触、胞间连丝） 紧密连接的功能：形成渗漏屏障，起重要的封闭作用；隔离作用，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使各自不同的膜功能；支持功能；维持细胞的极性，有利于物质的跨细胞转运。 锚定连接：与中间纤维相连的锚定连接：桥粒（相邻细胞，起支持和抵抗外界压力与张力作用）+半桥粒（）；与肌动蛋白纤维相连的锚定连接：粘合带（相邻细胞间形成一个连续的带状结构）+粘合斑（细胞与细胞外基质之间） 构成锚定连接的蛋白：细胞内附着蛋白：将特定的细胞骨架成分同连接复合体结合在一起；跨膜连接的糖蛋白：其细胞内的部分与附着蛋白相连，细胞外的部分与相邻细胞的跨膜连接蛋白相互作用或与胞外基质相互作用。 细胞三种通讯方式：通过信号分子；通过相邻细胞间表面分子的粘着或连接；通过细胞与细胞外基质的粘着。 间隙连接的功能：在代谢偶联中的作用：允许小分子代谢物和信号分子通过，是细胞间代谢偶联的基础；在协调细胞群体的生物学功能方面起重要作用。在神经冲动信息传递过程中的作用：电突触快速实现细胞间信号通讯；间隙连接调节和修饰相互独立的神经元群行为。在早期胚胎发育和细胞分化中的作用：提供信号物质的通路, 从而为某一特定细胞提供它的“位置信息”，并根据其位置影响其分化；肿瘤细胞之间间隙的连接明显减少或消失，间隙联接类似 “肿瘤抑制因子”。 间隙连接的通透性：降低胞质中的pH和提高钙离子浓度都可降低。 内分泌作用特点：低浓度；全身性；长时效。 胞间连丝的功能：实现细胞间由信号介导的物质有择性的转运；实现细胞间的电传导；在发育过程中，细胞连丝结构的改变可以调节细胞间的物质运输 细胞表面粘连分子特征：均为整合膜蛋白，在胞内与细胞骨架成分相连；多数要依赖钙离子或镁离子才起作用。 粘连分子类型：钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族CAM；整合素；质膜整合蛋白聚糖 细胞外被：细胞质 2

膜外表面覆盖的一层粘多糖物质，实际指细胞表面与质膜中的蛋白或脂类分子共价结合的寡糖链。作用：保护膜蛋白，细胞识别。 细胞外基质：分布于细胞外空间，由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的网络结构。功能：构成支持细胞的框架，负责组织的构建；胞外基质三维结构及成分的变化，改变细胞微环境从而对细胞形态、生长、分裂、分化和凋亡起重要调控作用；胞外基质的信号功能。 胶原：水不溶性纤维蛋白。功能：构成细胞外基质的骨架结构，细胞外基质中的其它组分通过与胶原结合形成结构与功能的复合体；在不同组织中，胶原组装成不同的纤维形式，以适应特定功能的需要；胶原可被胶原酶特异降解，而掺入胞外基质信号传递的调控网络中。 氨基聚糖：氨基己糖 + 糖醛酸；透明质酸作用：是增殖细胞和迁移细胞的胞外基质主要成分,也是蛋白聚糖的主要结构组分；在结缔组织中起强化、弹性和润滑作用；使细胞保持彼此分离,使细胞易于运动迁移和增殖并阻止细胞分化 蛋白聚糖：由氨基聚糖与核心蛋白的丝氨酸残基连接，具有多态性。 纤粘连蛋白的主要功能：?介导细胞粘着，进而调节细胞的形状和细胞骨架的组织,促进细胞铺展；?在胚胎发生过程中,纤粘连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必须的；在创伤修复中,纤粘连蛋白促进巨噬细胞和其它免疫细胞迁移到受损部位；?在血凝块形成中,纤粘连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。 植物细胞壁的功能：增加细胞强度，提供支持功能；信息储存库的功能：产生多种寡糖素作为信号物质，或抵抗病、虫害，或作为细胞生长和发育的信号物质

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