L1120细胞培养

一．实验目的

1．了解培养室的设置和设备。

2．学习无菌概念和无菌操作要领，熟练各实验器材的使用。

3．学习并掌握L1120细胞培养使用的器皿、器械的洗涤，消毒和灭菌。

4．熟练掌握培养基（RPMI1640）的配制，了解其它培养基的配制方法。

5．掌握L1120细胞传代培养的方法。

6．掌握细胞冷冻,复苏的方法.

7. 掌握体外培养L1120细胞的常规检查内容及方法。

二．实验原理

L1120细胞是一种肿瘤细胞。肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。

组织培养肿瘤细胞生物学特性

（－）形态和性状

培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

 （二）生长增殖

肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。

 （三）永生性

    永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。

 （四）浸润性

    浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。

 （五）异质性

    所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。

 （六）细胞遗传

    大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。

 （七）其它

    肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。

实验器皿的清洗与消毒

L1120细胞培养技术要求在无菌操作条件下进行，避免微生物及其他有害因素的影响。在L1120细胞培养培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。

1. 消毒灭菌概念

消毒 具有杀死致病微生物的作用或方法，称为消毒。通常只能消灭物体表面或环境中的一部分微生物，有能达到消灭所有微生物。

灭菌 指彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物，以及它们的芽胞和孢子，使物体成为无菌状态。

2. 消毒灭菌方法

⑴ 物理消毒灭菌法

通过高潮、射线、微波以及器械进行灭菌或除菌的方法均为物理灭菌方法。

① 射线消毒灭菌

主要使用6OCo、X射线进行消毒灭菌，可用于牛血清和塑料制品的灭菌。

② 紫外线消毒

紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2m的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3h，期间可间隔30min。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5m照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5m，照射时间30min为宜。

紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。

③ 干热灭菌

干热箱是常用的干热灭菌设备。主要用于玻璃器皿、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

④ 湿热灭菌

压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

⑤ 滤过除菌

滤过除菌是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。

（2）化学消毒法

应选择具有杀菌谱广、毒性低、无刺激性、性能稳定、无腐蚀性、作用速度快等优点的化学消毒剂。各种化学消毒剂可按其杀灭微生物作用水平分为高、中、低三种类型，可根据不同消毒目的选用，如：

75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，0.5%过氧乙酸等。

（3）抗生素消毒法

抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

培养基的配制

L1120细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配置而成，合成培养基它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基无法替代的，此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清（10%）。

传代培养

L1120细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。肿瘤细胞为悬浮型细胞可以直接分瓶培养，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

冻存与复苏

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

复苏后细胞观察

细胞复苏后观察细胞的形态，数量等。

三．实验仪器、材料和试剂

（1）实验器皿的清洗，消毒与灭菌的仪器、材料和试剂

1．仪器：超净工作台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。

2．材料：0.22μm微孔滤膜无臭氧型紫外灯，微孔滤膜，过滤器， 塑料桶 。

3．试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，0.5%过氧乙酸，重铬酸钾，浓硫酸，氢氧化钠，盐酸，DEPC, 一蒸水， 二蒸水， 三蒸水 。

（2）配置L1120细胞培养基的仪器，材料和试剂

1．仪器：蠕动泵1套，滤器1套，蒸馏器，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器，pH计。

2．材料：500mL、250mL盐水瓶，250mL或500mL培养液瓶，0.22m的微孔滤膜,饭盒,锥形瓶。

3．试剂：青霉素,链霉素,盐酸,双蒸水，小牛血清，去合成培养基（RPMI1640），NaHCO3。

（3）传代培养的仪器、材料和试剂：

1．仪器：倒置显微镜，二氧化碳培养箱、超净工作台等。

2．材料：L1120细胞、细胞培养瓶、96孔板、针孔滤器、注射器、滴管（吹打管）、移液枪、细胞计数板等。

3．试剂：0.25％胰蛋白酶、DMEM培养液（含胎牛血清FBS）、5mg/ml MTT、0.5％台盼蓝、双抗（青霉素+链霉素）、DMSO.

（4）L1120细胞冻存与复苏的仪器、材料和试剂:

1.仪器:4℃冰箱,-70℃冰箱,液氮容器,微量加样器,水浴锅,离心机.

2.材料:冻存管,离心管,细胞培养用材料,500ml烧杯,胶布,75%酒精棉球.

3.试剂:培养基(RPMI1640)，小牛血清，液氮。

四．实验步骤：

第一步实验器具清洗、包装、消毒与灭菌

（1）实验器具清洗

玻璃类 1、主要有：培养瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，离心管，试管，培养皿等。

2、清洗步骤：

泡在含有洗洁净的自来水中→捞出来用毛刷将实验器具各个面刷洗至少25遍→自来水冲洗25遍→过一遍一蒸水→泡入铬酸,过夜(24h左右)→从铬酸中捞出器具，自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子备用→用前高温灭菌（121℃，25min）→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡盐酸1天，然后清洗步骤与上面相同。

塑料类

1 塑料类器具主要包括：孔板，大枪头，瓶盖，滤器，采血管等。

2 清洗步骤：

（1）孔板，采血管

泡在有洗洁净的自来水中→用超声清洗仪超声3遍（每遍1小时，200C）→在含有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→过一遍一蒸水→泡入盐酸过一个礼拜→从盐酸中捞出后自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水（每遍3次），三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前包装好照钴→使用

（2）大枪头，盖子，滤器

在含有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→用超声清洗仪超声1遍（每遍45分钟，200C）→自来水冲洗→过三遍一蒸水（每遍3次），三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前包装好灭菌→使用

注意：

（1）烘孔板时温度不应太高，烘干后用报纸包裹，装入箱子内，照钴，便可使用。

（2) 新的培养瓶盖子泡旧5％稀盐酸1天→再用2%NaOH煮20min →自来水冲洗→洗洁精清洗→用超声清洗仪超声1遍（每遍45分钟，200C）→冲洗15遍→过三遍一蒸（每遍3次）→过三遍三蒸水→烘干使用 。

（二）实验器具包装

包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。

①瓶类：硫酸纸罩以瓶口,外罩二层牛皮纸用绳扎紧。

②小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。

③吸管、滴管口用脱脂棉塞上(不要太紧或太松)装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。

④无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。

（三）实验器具消毒与灭菌

1．物理消毒法

（1）紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。

（2）高压蒸汽灭菌 主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS、20×SSC等）。

手动高压灭菌锅操作如下：

①首先查看高压锅内的水是否充足，放入物品盖好盖。

②加热高压锅。将放气阀打开，放气5—10 min，以排除锅内的冷空气。

③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅（121℃）30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115 ℃）20 min。调节火力大小保持该压力。

④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。

⑤滤过除菌。用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90 mm、100 mm、142 mm……等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20 mm、25 mm等）。滤膜孔径有0.60 μm、0.45 μm、0.35 μm、0.22 μm、0.10μm等，以0.22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。

⑥在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。

⑦用布包好，湿热灭菌后使用。

2．化学消毒法

常用的消毒液有如下几种：

（1）70％（或75％）酒精：超净台里常备70％酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。

（2）0.1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。

（3）来苏儿水（煤酚皂溶液)： 主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。

（4）0.5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。

（5）乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。

（6）37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放入已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d后方可达到消毒空气的目的。

（7）将清洗灭菌后的物品标记、保存备用。

第二步 L1120细胞培养液的配制

（一）过滤器的准备和安装

清洗好过滤器，干燥，放入一张0.22m的微孔滤膜，用布包装好，15磅20min进行高压蒸汽灭菌处理。在超净工作台内安装好过滤装置，准备过滤。

（二）合成培养基的配制

①将干粉型培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用1/3水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌3h使其溶解。

将干粉溶于450毫升水中，充分搅拌使其溶解，用水冲洗包装内面，确保干粉都溶解成培养液

②根据产品说明的要求和实验补加3.7g NaHCO3,再搅拌1h。

③加双抗：最终浓度青霉素为100U/ml，链霉素100μg/ml。一般市售青霉素为80万U/瓶，将其溶解在4ml体积内，每1000ml培养液中加0.5ml，即成最终浓度为100U/ml。市售链霉素为100万U/瓶，将其溶解5ml体积内，也是每1000ml加0.5ml，使其最终浓度为100μg/ml。

④调节培养液的pH值为7.0~7.2。

⑤1000毫升容量瓶定容。

⑥过滤法除菌。

⑦分装于玻璃瓶中，4℃冰箱保存备用。

⑧使用时加血清。

（三）小牛血清的处理

市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。

将血清放入56℃水浴中30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。

（四）生长培养基的配制

除无清培养之外，各种合成培养基在使用前需要加入一定量的小牛血清（约10%）。

第三步 传代培养

（1）无菌室的灭菌

①进无菌室穿无菌服、戴帽子和口罩等；

②将紫外灯无人时打开紫外照射半小时；

③无菌室的所用物品要严格消毒；

④室内台面要保持洁净，做完实验后，用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等；

⑤ 保持无菌室每周清洗消毒一次；

⑥所用物品要一次性准备好；

⑦瓶口要用酒精火焰消毒；

⑧尽量减少出入。

（二）实验人员的无菌准备

①肥皂洗手。

②穿好无菌服，戴帽子和口罩等。

酒精棉球擦手.

④进入实验室后保持手的清洁，不要接触与实验无关的物品。

（三）操作实验

①超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。

②打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

③点燃酒精灯，取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

④倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

⑤从冰箱里取出血清，培养液等放置于实验台上，一次摆好。

⑥将培养液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

⑦将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。放置于培养箱中培养。

第四步 细胞的冻存与复苏

（一）细胞冻存的操作步骤

①取待冻存的细胞800转每分钟离心5分钟，弃上清收集细胞。

②加入适量冻存液制成细胞悬液，并可适量增加小牛血清浓度至20%。

③细胞悬液装入冻存管中，用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类，时间及冻存条件等）。

④冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃1.5-2h，再转入-70℃4-12h后即可转移到液氮内，做好标记。

（二）细胞复苏的操作步骤

①取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。

②从液氮中取出冻存管立即投入40℃水中迅速解冻。

③取出冻存管，用75%酒精清洗管口，打开。

④离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗一次，加入3ml新鲜培养基，于小培养基中培养。

第五步复苏后的细胞生长观察

主要观察细胞的一般形态，如大小、性状、折光性等，可以通过染色进行进一步的观察。

五、实验结果

1、第一次进行完全培养基多瓶分装时，由于滤器的滤膜没有装好，导致培养基外渗。

2、第一次进行传代后观察细胞形态，细胞为椭圆形、稀少、悬浮。

3、成功地进行了冻存与复苏。复苏后立即观察细胞形态和第一次传代的细胞形态基本相同。

复苏几天后，培养的所有细胞死亡。

六、分析与讨论

1、实验前装滤膜时取得滤膜质量不好，重新挑选滤膜后成功进行了培养基的过滤。

2、复苏后培养的所有细胞死亡。分析原因有以下几点：（1）器皿不清洁。实验室玻璃器皿上的有毒残余物会导致细菌、组织和细胞培养出现杂质。因此，残余物的清洗和最适的冲洗对于可靠的结果是至关重要的。由于实验器皿多而新，难免有的器皿没有清洗干净或没有充分地用蒸馏水清洗。（2）本次综合实验小组多，有些同学进出无菌室的装备不符合实验要求，带入了病原微生物。（3）细胞实验室无菌要求高，对器皿、试剂、仪器、操作人员都要进行严格的消毒，器皿、试剂等要高压灭菌，灭菌结束后要小心存放，以避免被污染从而使细胞死亡。

七、注意事项

1、 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2、 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3、 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4、 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO等，并避免尖锐针头之伤害等。

5、 定期检测下列项目：5.1.CO2钢瓶之CO2压力5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

6、 粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，细胞娇弱，放置时间不宜过长。

7、 开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶拿到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅拿出后，最好找个毛巾擦干上面的水。

8、 无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。

9、 确保实验器材绝对清洗干净。

10、 培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

11、 小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。

12、 L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。

13、 安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中 。

14、 培养瓶要轻拿轻放，尽量不要接触培养瓶瓶口部位以防污染。