实验篇

实验一 实验器材的清洗

实验物品

（一）每一大组公用物品（每班分6大组）

吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。

（二）每一小组公用物品（两人一小组）

刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶 及塞子4个、l0毫升盐水瓶 及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。

（二）公用物品

小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双 、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。

清洗注意事项和要求

（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。

（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。

（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。

（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。

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（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。

（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。

（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。

（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。

操作方法

（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法

常用清洁液配方

重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。

以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。配好后倒入洗液缸中备用。新配制的清洁液呈棕红色。当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。

（二）物品的清洗

1、新购置物品玻璃器皿清洗步骤

清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干（或50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。

2、用过的玻璃器皿清洗步骤

带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→刷洗→自来水冲洗→凉干（50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。

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3、橡皮帽和橡皮塞的清洗

新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法如下；

2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2～5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用．

4、塑料制品（塑料培养板、针头式加压塑料小滤器）的清洗

用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签刷洗→流水冲洗→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→去离子水浸洗三次→双蒸水中浸泡24小时→晾干备用。注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开，按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，备用。

5、不锈钢除菌滤器的清洗

先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2～3次（去离子水浸泡24小时）→三蒸水冲洗2～3次或浸泡24小时→干燥备用。

6、镊子、剪刀

纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。

7、金属滤网

自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。

实验二 实验器材的包装和消毒

实验用品

实验一中清洗的所有物品、脱脂棉一卷/班、纱布一卷/班、高压锅一个/班、无菌操作台一台/组、牛皮纸1张/组，纸绳一卷/组、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔一个/组。

实验方法

（一）包装

1、包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。

2、瓶类：需用局部包扎，用牛皮纸包扎。随后单个或几个一起用纸包好。 239

3、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等）加脱脂棉，吸管、滴管，随后置玻璃吸管筒或铜制、铝制吸管筒内（内放纱布），塞上棉塞或盖上有孔盖子（内外孔对好），外包上两层牛皮纸，若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。

4、带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。

6、为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面注以符号或写上字“－” “＋”。

（二）器皿的消毒

干热消毒主要用于玻璃器皿的消毒。160℃、l20分钟，消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。

湿热消毒即高压蒸汽消毒：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。消毒时间是从压力达到15磅，温度达到121℃时算起。一般蒸气消毒30分钟。橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。消毒后，调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热，而不至于激烈的沸腾。

各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：

培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟

布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟

实验三 培养用液的配置

实验用品

实验器材：

1000ml的量筒2个，1000ml的烧杯2个，磁力搅拌器一台，玻璃棒两个，感量0.1mg的分析天平,100ml的盐水瓶若干,

化学试剂:

NaCl,KCl, KH2PO4 ,Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O, NaHCO3, 小牛或胎牛血清,胰蛋白酶,醋酸。

实验要求及方法

（一）PBS液

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实验室常用含0.85%,pH7.2的PBS(简称pH7.2的PBS)

1. PBS贮存液配法

NaCl(AR) 8.5g； KCl(AR) 0.2g； KH2PO4 0.27g；Na2HPO4.12H2O 2.85g (或Na2HPO4.2H2O 1.13g) 溶于100ml双蒸水中。

2. PBS应用液配法

取贮存液50ml加双蒸水450ml即成,经103kPa(121.3℃)15分钟灭菌,置室温或4℃保存备用。

3．配制BSS液的要求

（l）BSS液中各试剂规格为一级GR试剂（guaranteed reagent）或二级AR（analytic reagent）试剂.

（2）配制后液体呈桃红色，pH 7.4左右没有混浊和沉淀。

（3）含钙镁离子的物质要单独溶解.

（4）可配制10倍浓度的贮存液，滤过消毒，分装，每瓶10毫升；冰箱保存。使用时每瓶加三蒸水至 l00毫升。

（5）配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无钙、离子的D—Hanks液，或PBS液。

（二） 血清灭活处理的方法:

1.选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。

2.对照瓶内放入与血清等体积的水。

3.温度预试：使水浴锅温度保待在56℃。放入内4～5支温度计，选择2～3支温度计，

4.血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至56℃时定时30分钟。

5.大瓶血清灭活后进行分装。

6.分装后，抽样做无菌试验，－20～－70℃保存。

（三）配制合成培养基（液）注意事项。

1．用三天内制备的玻璃三蒸水配制培养液

2．按二周用量配制为宜，配量过多，存放时间过长会造成培养基老化、变质、产生沉淀。

3．培养液中各成分是否完全溶解的判断方法：将培养液置室温或4℃冰箱30分钟后，观察瓶底有无颗粒产生。

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4．根据实验需要，在培养液中加入适量37℃单独溶解的NaHCO3溶液。正常体细胞培养液中NaHCO3量为20～22克／升，肿瘤细胞为1.5～1.7克／升。

5．干粉培养基不易溶于水，实验室采用空气CO2助溶法即将甲液在磁场上搅拌一段时间，当甲液pH值下降到5.8左右时（橙黄色）氨基酸和维生素基本溶解,在甲液内再加入溶解有NaHCO3的乙液，两液混和后，营养液pH值为7.0～7.1，抽滤后pH值上升0.1。此法操作简便，营养液pH值稳定。

（四）胰蛋白酶液

胰蛋自酶是一种黄白色粉末，水解蛋白质时作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架．从而使细胞分离。胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1:250两种,即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。一般来说，浓度越大、温度越高、作用时间越长，对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度就会损伤细胞。常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25％利0.125％，作用温度37℃或室温，pH7.4左右。CaMg和血清的存在都会降低其活力

O.25％胰蛋白酶液的配制方法如下。

l.过滤消毒法。

①按实验需要称取酶粉，用少量D-Hanks液或PBS液将胰蛋白酶粉调成糊状。 ②加适量D-Hanks液或PBS液(橙红色)，磁力搅拌溶解

③溶解后的酶液（深红色）滤过除菌，分装，-20℃冻存。

2.高热消毒法。利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性对其进行高热消毒。 ①、按实验需要称取酶粉溶于1毫摩尔／升pH3.0的HCl中。

②、酶液和2倍D－Hanks液同时在0.1兆帕，120℃条件下灭菌20分钟。

③、两液冷却至室温时，等量混匀。酶液浓度高时，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，两液等体积混匀。然后用10摩尔／升的NaOH调消化液PH值至7.2（橙红色或深红色）

④、经计算，消毒后酶浓度下降50％。如消毒前酶浓度为0.1%～0.5％，消毒后为0.05％～O.25％。高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。

（五）PH调整液

1、 NaHCO3溶液常用的浓度有7.4％、5.6％、3.7％三种，配制时37℃三蒸水溶解后通过滤膜过滤除菌，分装于安瓶中4℃冰箱保存，每支一次用完。使用时，NaHCO3液要逐滴加入，并不时搅动培养液。以防pH值过高。

242 2+ 2+

2、 10％醋酸液 高压灭菌,分装， 4℃冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO3液。 （六）200毫摩尔／升L-谷氨酰胺

L－谷氨酰胺2.9222克（M=146.15），加适量50℃三蒸水溶解．定容至l00毫升，滤过除菌，1毫升／安瓶，一20℃保存使用时每 l00毫升培养基中加 1毫升谷氨酰胺。

（七）抗菌素液

加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。青霉素、链霉素液又称双抗溶液。

培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。

（八）细胞用液的分装要求

l.使用严格无菌操作。尽量减少试剂在空气中的暴露时间。

2.根据配量准备分装瓶和瓶塞，分装瓶规格、数量应根据实验需要准备。避免因包装瓶过大、贮液时间过长或反复冻融使用造成营养成分丢失和微生物污染。按一次用量或一周内用量挑选小包装瓶。融化后的液体置4℃保存。

3.分装前做好分装量标记，分装瓶内液体量要小于瓶容积的2／3。

4.做好分装瓶标记，包括试剂名称、浓度、配制日期、组号。

※采用边过滤边分装的方法。瓶口的液体用干酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包装。

实验四 组织细胞的原代培养

实验操作要领和注意事项

（一）原代细胞培养操作要领

1、原代细胞混匀操作要领

①火焰消毒吸管，用Hanks液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。

②吸管头插入管底。

③用吸管反复轻轻吹打组织块。

2、器械的使用操作要领

①用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。

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②器械置无菌干纱布内擦一下，迅速通过火焰，冷却后使用。

③用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。

④器械按浸泡消毒的顺序使用.

⑤各套再消毒器械不可混用。

3、除去组织块多余水分的操作要领

用吸管将组织块推向器皿一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。

注意：多余水分若不除去，会使组织块剪切不细。消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。

4、细胞计数操作要领

①用吸管混匀待计数的细胞悬液。

②将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入细胞计数池中。

③沉降1分钟，低倍镜下计数血球计数板四大中格中的结构完整的细胞，小细胞团计数为l。

④计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。

（四大中格细胞数／4）×10000=细胞数／毫升

注：细胞计数板上，每－中格体积为0.1立方毫米。

（二）原代细胞培养注意事项

1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2％碘酒液消毒，成年鼠先用3％～5％碘酒液消毒，后再用75％酒精消毒。

2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3、 吸取液体前，瓶口和吸管口应行火焰消毒；吸取液体时，避免两者碰撞。

4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。

5、实验者离开超净台时，要随即用肘部关闭工作窗。

6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。

7、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用PBS液冷却。超净台内温度、湿度较大，在夏天工作时台内散热更慢。因此进行细胞悬液混匀、接种时，离火焰要稍远些。

实验方法

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一、鸡胚成纤维细胞培养

通常应用胚胎或幼小动物的组织来制备细胞培养，因为它们分裂旺盛，容易生长。各种动物的大多数组织细胞都能在体外培养。应用最多的为肾、肺、皮肤等，鸡胚组织应用最为普遍。

（一）鸡胚的处理

1． 取10～11日龄的鸡胚，在气室部用5％碘酒消毒，用酒精脱碘。

2． 用灭菌镊子击破和除去该部卵壳和卵膜。

3． 以眼科弯头镊子撕破绒尿膜和羊膜，钩住鸡胚头部，提出移于平皿内。

4． 去头、脚、翅和内脏。用Hanks液或PBS液洗去血液，重复三次。

5． 用外科剪剪成1～2mm大小的碎块。加Hanks液约20m1混匀，稍静置使组织块下沉。用灭菌吸管将混有红细胞及碎片的悬液充分吸去。依同法再洗2—3次，至Hanks液不浑浊为止。也可将鸡胚投入20m1注射器(不带针头)内挤出，以替代剪碎。

（二）蛋白酶消化

1． 将0．25％胰蛋白酶溶液(pH7．8)于37℃水浴中预热

2． 弃去Hanks液。

3． 按组织块的3～5倍，将预热好的0．25％胰蛋白酶溶液加于装有鸡胚的

玻璃容器中。每个鸡胚约需胰蛋白酶液l0ml。

4． 将玻璃容器放在37℃水浴中，每隔5min轻轻摇匀一次。

5． 如发现组织块变得散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够，约需l 5～

20min．

6． 将玻璃容器取出水浴，静置1～2min，吸去胰蛋白酶液，加含犊牛血清

的Hanks液约20m1，轻轻摇匀后吸去，如此重复一次，目的是洗去残余

的胰蛋白酶和抑制其消化作用。

7． 加入生长液，按每个鸡胚10m1左右，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落

分散。

8． 静置1～2min，使组织块下沉，细心地轻轻吸出细胞悬液，另置一25m1

玻璃容器中。如此反复数次，将各次收获的细胞悬液合并一起.

9． 用灭菌纱布过滤一次，除去偶尔吸入的组织块。必须注意的是，每次吹

吸次数不宜过多，一般5～6次即可，太多细胞容易受损。

（三）细胞计数 可借染色法区别活细胞和死细胞，并计算每毫升细胞个数。

1．配制台盼蓝溶液 取0．2g台盼蓝，溶于100m1磷酸平衡盐水中贮存， 245 3

临用前再稀释10倍。这是一种活体染液，完整的活细胞不被染色，而细胞膜受损后才染成蓝色。

也可用0．01％结晶紫液(用0.lmo1／L柠檬酸配制)染色，这时细胞核被染成蓝紫色，但只能计数而无法区分死活。)

2．取摇匀的细胞悬液1滴加于玻片上，加染液4滴，混匀后静置4～5min。

3．吸取细胞悬液少许，滴到血细胞计数板上，计算四角4个大格内完整的细胞数，如几个细胞聚集一起，则按一个细胞计算。然后将活细胞总数换算成每m1中细胞数，最后还要乘以5，因为细胞已被染液稀释5倍。

活细胞数／ml＝（4大格活细胞总数／4）×l0 000× 5

（四）稀释和分装 根据细胞计数的结果，以生长液配成每m1含20～40万细胞的悬液，分装细胞培养瓶。微量细胞培养板每孔(0.3cm)0.1m1；转瓶培养每100ml容量加10m1细胞悬液。必须注意，瓶口务必塞紧，不能漏气，否则在培养过程中C02不断逸出而使营养液迅速变碱，而且容易被细菌污染。

（五）生长液和维持液的配方 鸡胚细胞较易生长，常用者有下列两种。 1．0．5％乳蛋白水解物 95％

犊牛血清 5％

青霉素 100IU／m1

链霉素 100Ug／m1

此为生长液的配方，如为维持液可将血清量减至1—2％即可。

2．Eagle氏MEM 95％

犊牛血清 5％

青霉素 100IU／m1

链霉素 100Ug／m1

此为生长液的配方，如为维持液可将血清量减至1～2％即可。

细胞悬液分装后置37℃温箱内静置培养，几小时后细胞即可贴附于瓶壁，24～48h长成单层，此时即可供接种病毒之用。如发现液体浑浊(有细菌或酵母生长)或有菌丝体 (有霉菌生长)，应立即弃去。 如为微量细胞培养，可用涤纶胶布将板面密封，置C02培养箱内培养。如为转瓶培养，可将培养瓶放置在转鼓上，以6～12r／h的速度在37℃培养。 2

二、兔肾上皮细胞培养

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（一）实验材料：

1. 兔婴(出生48小时内尚未进食兔婴，体重300～500g)。

2.培养基与试剂：含10%FBS(或CS)的MEM、CMF-Hanks液、0．25胰酶/CMF-PBS。

3.器具：各种吸管、离心管、80～100目尼龙网或不锈钢筛网、三角烧瓶、培养皿、瓶，手术刀、剪、镊，1%新洁尔灭消毒缸、解剖板等。

（二）实验方法

1.取肾：取2日龄内兔婴，将其断颈处死后，放入1%新洁尔灭溶液中浸泡lOmin。取出兔婴，放置瓷盘内的木板上，背部向上，四脚钉住固定。用碘酒，酒精消毒背部皮肤，用剪刀和镊子将背部皮肤剪开剥去。另换剪刀，在腰部背脊长肌两侧剪开腹腔如蚕豆大的缺口，即可看到肾。用尖头镊子夹紧肾蒂，剪断血管及结缔组织等，将肾提出放在平皿内。

2.组织处理及消化：剪下肾皮质部分，移入小三角烧瓶内，用小剪细剪成1mm左右的组织块，用PBS或Hanks液洗3次，吸弃上清液，视其沉下的组织块量，约加10倍量的0.25%胰酶，于37℃水浴中消化30min。以下步骤及方法与鸡胚细胞制备相同，不赘述。

3．胰蛋白酶消化

分热消化和冷消化两种。热消化与鸡胚成纤维细胞相同，但时间必须延长到25～30min。如欲获得更多的细胞，可在消化瓶内预放几十粒玻珠，消化后转动消化瓶使细胞脱落。在吸出的胰酶～细胞悬液中加入犊牛血清2m1以终止酶的作用。

剩下的组织块另加胰蛋白酶液继续消化20min，重复上述步骤1～2次，即可将组织几乎消化殆尽。 许多实验室喜用冷消化，即在组织块内加入7一10倍量的胰蛋白酶液，在4℃冰箱内消化过夜，翌日晨取出，按热消化法处理。

4、细胞计数 同鸡胚成纤维细胞。

5、生长液和维持液的配方

1）．0．5％乳蛋白水解物 45％

Eagle氏MEM 45％

247 3

犊牛血清 10％

青霉素 100 IU／m1

链霉素 100 Ug／m1

此为生长液的配方，如为维持液可将血清量减至3—5％。

2）．Eagle氏MEM 90％

犊牛血清 10％

青霉素 100 IU／m1

镕霉素 100 Ug／m1

此为生长液的配方，如为维持液可将血清量减至3～5％。

6、细胞悬液的稀释和分装 与鸡胚成纤维细胞同，细胞浓度为50万／m1。在37℃培养4～5日可以长成单层。

三、鸡胚心肌块的培养

实验用品

1.孵育9～11日龄鸡胚一个

2.培养液：MEM+20%小牛血清（CS），CS，无钙镁Hanks液（CMF-Hanks）或pH=7.2的PBS。

3．器具：各种吸管、弯头吸管，60mm培养平皿或25cm培养瓶，90mm玻璃平皿一个，60mm玻璃平皿3个，镊子、眼科剪、吸管架，鸡卵架等。 2

实验方法

1.鸡胚摘出：

取9～11日龄鸡胚于卵架上，用碘酒、酒精消毒鸡胚气室侧，用镊子敲开气室部，剪开气室部蛋壳，用镊子摘除卵壳膜，轻轻夹住鸡胚颈部取出鸡胚于无菌90mm平皿内，注意不要强拉鸡胚颈部。

2.制备心肌块：

用镊子固定鸡胚，从腹部向胸部切开，用镊子摘除心脏，移入装有10mlCMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的60ml的平皿内，用刀将心房和血管等切除，心室放CMF-Hanks 248

液或pH=7.2的PBS的平皿中充分洗涤，然后将心室移入另一装有CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿内,用刀将心室切成适当大小(1～2mm)小块,于CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS液中洗涤数次,转入装有少量生长液的平皿中暂存。

3.培养与观察：

将组织小块转移到培养瓶内，每只体积为25ml的培养瓶内可放置20～30块组织轻轻地倾斜摆动培养瓶，使组织小块均匀地分布于生长细胞瓶内壁表面上。把瓶盖盖上，放入恒温培养箱内，静置18-24小时，添加少量培养液。

待外植块均巳粘附玻壁上后，约经过2天后，在每只培养瓶内添加足量培养液。培养至3～5天后，于相差显微镜下观察心肌细胞的形态及节律性收缩现象。 3

实验五 传代细胞的培养

实验材料

1．蛋白酶消化液：主要是用无Ca、Mg的平衡盐溶液或者PBS配制的0.08%～0.25%(m/V，下同)胰蛋白酶溶液，其中也可以再补加0.02%的EDTA(或1 mmol／L)。有时候还需要0.02%～0.03%或200IU/ml的胶原酶溶液甚或其它的消化液。

2．培养器皿：一般与进行原代培养时所用类型相同。所需数量须根据拟传代的规模而定。

3．培养液及平衡盐溶液：同原代培养。 2+2+

实验方法

（一）贴壁细胞传代培养方法

1．取需要传代的细胞培养瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎片，然后连同生长液一起倒出，用无钙镁的磷酸平衡盐溶液洗涤2次。

2．从无细胞面加入0．25％0.1%胰蛋白酶液或0．02％EDTA液（或两者等量混合）4～5ml，将该培养瓶翻转，使消化液浸没细胞层。

3．在37℃放置8～15min。中途取出，用肉眼或低倍显微镜观察。如单层边缘略有卷边，或低倍下细胞间已有缝隙，细胞层出现布纹孔，即表明消化适度。（如果细胞 249

突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形，应立即终止消化。）

4.将培养瓶倒置，使细胞不再接触酶液，继续在37℃放置几分钟。

5.取出，倾去酶液越彻底越好，加入生长液后用吸管吸吹数次，使细胞分散。

6.装入离心管，离心(1000r／min，5min)。除去上清含酶溶液。

7.用培养液将细胞沉淀重新悬浮。计数并调整细胞密度。

8．每瓶细胞单层可扩大分装2～4瓶。

9．37℃静置培养1～2天又可长成单层

（二）悬浮细胞传代培养方法

悬浮培养的细胞可直接将培养物吸取一部分或者将培养物离心后再分成几部分并接种培养即可。

1、将培养物转移到离心管内，离心(1000r/min，5min)。

2、吸出上清液。给细胞沉淀加入培养液重新悬浮。

3、分别取部分细胞悬液，接种在数个培养皿内。

4、补加培养液。入培养箱继续培养。

若为直接分部传代，仅需停止搅拌或摇动，待细胞自然下沉。吸去大部分上清培养液，再用吸管吹匀培养物成细胞悬液。分别吸取部分细胞悬液接种在数个培养器皿内。补加培养液。入培养箱内进行培养。

实验六 病毒的接种

实验用品

实验试剂：青霉素，链霉素，Hanks液，细胞维持液。

实验仪器：离心机，水浴锅，吸管，显微镜，培养箱。

实验材料：病料，长满单层的细胞。

实验方法

首先要选择对特定病毒易感的细胞培养。当细胞长成单层后即可接种病毒或待检病料。一般按下列步骤进行。

1．将病料制备成1：10匀浆，离心沉淀，取上清，每m1加青霉素1000IU和链 250

霉素1000Ug,室温放置1一2min。如病料为粪便，则抗生素量要增加10倍。

2.弃去细胞培养生长液，用预热至37℃的Hanks液(pH7.2—7．4)洗一次，以除去细胞碎片等。

3．滴加病料上清，接种量约为生长液的1／10，原则是使细胞单层都能接触病料为度。在37℃放置1／2～2h，使病毒吸附于细胞膜。在此期间可以转动细胞培养瓶2—3次，以防部分细胞末接触接种物。

4．弃去接种液，用pH7．2Hanks液将细胞单层洗2—3次，以除去接种液内可能存在的对细胞有毒的物质，粪便等特别要注意。如果接种液就是细胞培养传代病毒，则可省略此步骤。

5．按生长液量换加维持液，在37℃培养。

6．逐日在低倍显微镜下检查CPE，或进行其他试验。接种病毒后第2天如发现维持液浑浊，则表明有细菌污染，应该弃去。真菌污染常在较后几天才能发现。

上述为大多数病毒的常规接种方法。有些如细小病毒需要在分裂旺盛的细胞中才能生长，这时病毒接种应在细胞贴壁后不久进行，甚至在细胞分装时接种。还有一些细胞结合性病毒如马立克氏病毒等，接种的病料必须是完整的感染细胞而非上清液，接种后细胞单层不能用Hanks液将感染细胞洗去。

实验七 空斑形成技术

实验原理

病毒的空斑犹如噬菌体的噬斑，故空斑和噬斑(又称蚀斑)含义相同。动物病毒的空斑形成试验。先制备成致密无孔的细胞单层；再感染适当量的病毒；尔后加琼脂复盖和染色，加琼脂复盖的用意有二：其一是将每个病毒体都限制在它原来吸附和进入的地方；其二，以衬托出空斑形成的地点。因每个病毒体只能在它吸附和进入的地方繁殖，故1个病毒体只形成一个空斑。换言之，1个空斑亦相当于1个病毒体。

操作方法

1．在细胞培养瓶或平皿中使细胞长成密集的单层，不能有空隙(细胞接种浓度不低于1×l 0／m1)。

2．吸去生长波，用维持液将细胞单层洗一次。

251 6

3．病毒检样用Hanks液(pH7．2—7．4)作连续10倍稀释。要能检出孤立可数的空斑，病毒浓度最好在100～500TCID50／m1，稀释时要注意。每一浓度接种2个培养瓶。接种剂量随容器大小而异。直径6cm的平皿接种量约0．2ml，以此类推。

4．将培养瓶在37℃培养60min，使病毒吸附于细胞，每15min将培养瓶轻轻转动，使接种液分布均匀。

5．将培养瓶放在水平的桌面上。

6．加入融化后冷却到42～44℃的琼脂覆益层，厚度约3mm。覆盖层的组成如下：

2．25％高级琼脂(或琼脂糖) 40ml； 2倍浓缩营养液 50m1； 犊牛血清 5m1； 1：1000中性红溶液 5m1；青霉素 100IU／ml； 链霉素 100Ug／m1。

先将琼脂用双蒸水配成2．25％浓度，经12l℃高压蒸汽灭菌15min。使用前在100℃水浴中融化，然后使水浴冷却到44℃。这时将其余成分放在水浴中预热15min。把它们加入琼脂中，轻轻混匀，不能产生气泡。这时加入7％NaHCO3使pH调到7．2～

7．4。

7．琼脂凝固后将瓶(平皿)翻转，在37℃培养。如果是培养瓶，只需将瓶塞塞紧即可；如果是平皿，应将其放在C02培养箱内培养，以保持适宜的CO2浓度和湿度。

8．培养3—4天后计算空斑数。空斑呈淡白色，背景呈谈红色。

实验注意事项

1．琼脂的质量是空斑形成的关键，必须选用高级琼脂或琼脂糖。

2．琼脂加入前温度切忌太高，以免影响细胞活力。在44℃水浴中加入NaHCO3后保留时间不能超过20 min，否则C02逃逸太多而使营养液变碱。

3．只要细胞不衰老，培养时间尽量长些，使空斑充分发育。

4．中性红常对细胞有毒性，有人建议在琼脂层中不加。在培养2～3天后再加第二覆盖层(用双蒸水配制1％琼脂，内含0．01％中性红)。此层的厚度约1mm即可。更为简单的办法是在检查空斑前瓶内加入灭菌的0．01％中性红溶液，在37℃放置2h，倾去后观察。 也可用其他染料代替中性红，如台盼蓝，前者只染活细胞，后者只染死细胞。

5．中性红是光敏活体染料，感染细胞如在可见光下培养即不能产生正常的空斑。观察时光线不宜太强，时间不宜过长。中性红溶液最好现配现用，或在暗处短期保存。 252

实验八 细胞的保存

细胞的冻存方法

1．实验用品

对数生长期细胞(证明无支原体污染)；0.25%胰蛋白酶；BSS 培养液；DMSO(优质无色)；吸管；离心管；细胞冻存管(2m1)；酒精灯 ；标记小牌和线绳；纱布小口袋(三层)。

2．实验程序

(1)细胞：选对数生长期细胞；收集细胞24小时前换液一次；

(2)计数：按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达5×10/m1(如一瓶细胞数量不足则用两瓶或更多的细胞)，离心去上清；

(3)冻存液：先用培养液9份＋DMSO 1份(或甘油)配成10%的DMSO冻存液；按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬；

(4)分装：分装入无菌细胞冻存管中，每管加1.5毫升细胞悬液；

(5)封口：用塑料冻存管时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安瓿口后，仔细检查，定要封严，必要时需进行检验。

※为安全起见，把安瓿缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明细胞名称，冻存日期，以便日后查找。

(6)冻存：当前已有专用细胞冻存器，在无冻存器的情况下，可用手工办法：把冻存物先放置0℃ 30min，-20℃ 冰箱中放置2小时，液氮上层过夜后直接投入液氮罐。 ※检验方法：将安瓿浸入预冷的0．05％美蓝溶液中，在4℃放置30min。这样一方面可使冷冻保护剂(二甲基亚砚)与细胞之间平衡，另一方面检查安瓿封口是否严密。如发现美蓝液进入安瓿，即证明封口渗漏。这是极其危险的务必毫无保留地将其弃去或重封。因为留有微孔的安瓿在液氮罐中液氮会渗入，以后取出时液氮会迅速气化而导致安瓿爆炸。 6

细胞复苏的方法

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1．实验用品

75%酒精 ；培养液；BSS；离心管；搪瓷罐或铝锅(带盖)。

2.实验程序

(1) 从液氮罐中取出冻存管

(2)迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐或铝锅中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻，

(3)剪开纱布口袋，取出安瓿，用70%酒精擦试消毒后，净化台上打开盖(如为玻璃安瓿则折断安瓿颈部)；用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮；

(4)低速离心(500～1000转/分)5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。

(5)加入培养液适当稀释后，再移入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

注意：安瓿内冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做1:10倍或1:20倍的稀释(细胞数/毫升)，一般每瓶细胞接种浓度为5×105/ml，因此冻存密度应达到107/m1，在稀释20倍时，仍能保持5×105/m1数量。

实验九 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

实验原理

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂活性，因些细胞中有着较多的分裂相。在试验中需加以秋水仙素或秋水仙酰胺，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗处理及固定、滴片步骤，便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。此法不需无菌操作，设备简单，所用时间较短。

实验用品

实验试剂：秋水仙素350μg/ml 10g 0.25ml,20g 0.5ml， 0.85NaCl溶液, 50%酒精溶液；0.075mol／L KCl,37℃; 固定液：甲醇:冰醋酸=3:1。

共用物品：离心机，显微镜，Giemsa染色液。

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每组所需物品：注射器 1毫升2个，10毫升注射器1个，离心管5个，剪刀两把，小白鼠5只，微量移液器1把（带枪头），玻片5片，酒精棉球。

实验操作方法

1． 处死小鼠前3～6小时向小鼠腹腔中注入秋水仙素(按每克体重5～8μg量注入)。

2．断颈椎处死小鼠。

3．剪开腹腔，剥离出两条后肢，由股骨关节处剪断，取下后肢(注意不要将股骨剪断)。

4．将骨外面的肌肉尽可能剪掉，剩下附着在骨骼上的少量肌肉，用棉花或纱布蘸75％的酒精来回搓，直至骨骼外不带任何肌肉为止。

5．剥离股骨，并将股骨头的两端剪去少许，使共成为平面，然后用较细的注射器针头小心插人骨髓腔中，将骨髓腔穿通(不可用力过大，以防骨骼破裂)。

6．将1m1注射器的针头插入骨髓腔1／2部位， 然后将股骨浸入盛有0．85％生理盐水的离心试管中，操纵注射器将骨髓细胞冲洗到离心试管内，直至骨髓腔呈白色为止。丢弃股骨，拍打离心试管中的细胞使其散开。

7．用1000转／分钟的速度离心8～10分钟，弃去上清液，留下细胞。向细胞中加入4～6ml在37℃预热的0．075mol／L KCl溶液，拍打均匀，置37℃恒温箱中20～40分钟进行低渗处理。在此期间同时配制固定液，即甲醇加冰醋酸(3：1)，放入密闭的瓶中，置4～6℃冰箱中备用。

8．低渗完毕，立即加入lml新配制的预冷的固定液，并用吸管抽打均匀，进行预固定。然后用1000转／分钟的速度离心8～10分钟。

9．弃去上清液，沿离心管壁向沉淀的细胞团中徐徐加入新配制并预冷的甲醇—冰醋酸固定液4～6ml，用吸管轻轻地将固定液与细胞团抽打混匀，置室温下固定25～30分钟。

10．用1000转／分钟速度离心8～10分钟，弃去上清液。

11．再次加入固定液，抽打均匀后，将试管置于4℃冰箱中固定30分钟或更长时间，必要时也可过夜。

12．用1000转／分钟速度离心8～10分钟，弃去上清液，

13．根据管底沉淀细胞的多少，加入新配制的固定液0．3～0．5m1，并用吸管将细胞团轻轻吹打散开，形成悬浮液。

255

14．滴片：将干净的载玻浸入50％酒精溶液中，并置4℃冰箱中预冷。使用前取出载玻片放入冰柜5～10分钟后取出，用吸管吸取细胞悬液从一米高处滴在预冷的载玻片上，每张载片上滴1～2滴但勿重叠，然后用镊子夹住载玻片的一端，在酒精灯火焰上过一下，使染色体更好地散开。

15．染色：用pH6．8的磷酸缓冲液将姬姆萨母液稀释10倍，放入染色缸中，将制备好的晾干的染色体标本载片投入染色缸中，染色10分钟。

16．迅速用自来水将染料冲洗掉，将载片标本晾干，用光学显微镜镜检，必要时可用盖片封后保存。

实验十 脐血中单核细胞的分离与培养

实验原理

从混合的细胞悬液中获取目的细胞的过程叫细胞分离（cell separation ）。不同的细胞具有不同的形态和功能特征，细胞的形态特征反映在其物理性状上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和黏附能力等存在差异；而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面的蛋白质（表面标记）来体现，根据不同形态和功能特征，可以将各种目的细胞从混合细胞群体中分离出来。

一步梯度密度离心法: 将细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，密度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介质的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体积较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞分离开来。

一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成玫瑰花环的淋巴细胞。一步密度梯度法常用的分离介质是Ficoll-Hypaque，也可用Percoll、动物血清、BSA等。

实验用品

试剂：【按两个脐血标本（60-100ml）即两次实验设计耗材量 】

1、 Ficoll—Hypaque分离液(密度1．077l ±0．001g／m1)：一瓶。

2、 D-MEM/F-12（1×）、liquid、1∶1，11330-032， 500ml （GIBCO） 256

3、 表皮生长因子【epidermal growth factor( EGF)、Human、Recombinant，13247-051， 100μg （GIBCO）】：贮存液（2μg/ml）配制方法：100μg溶解50 ml三蒸水中，过滤除菌分装注射液瓶（2ml～5ml/瓶）， -20℃保存。使用时按100ml培养液加入1ml即可。

4、 成纤维细胞生长因子【basic fibroblast growth factor

（bFGF）,13256-029,10μg（GIBCO）】：贮存液（2μg/ml）配制方法：10μg溶解5 ml三蒸水中，过滤除菌，分装注射液瓶（1ml/瓶），-20℃保存。使用时按100ml培养液加入1ml即可。

5、 青霉素/链霉素（100×）贮存液。按常规方法配制。

6、 谷氨酰胺（100×）贮存液配制:取0.3 g谷氨酰胺溶于10ml三蒸水过滤分装, 分装注射液瓶（1ml/瓶），-20℃保存。使用时按100ml培养液加入1ml。

7、 pH调整液【NaHCO3常用浓度为7.4%、5.6%、3.7%（m/v）。高压灭菌的10%的醋酸溶液。HEPES（化学全名羟乙基哌嗪乙硫磺酸）溶液：是一种氢离子缓冲剂，一般培养基内含20mmol/l HEPES即可达到缓冲能力。】

8、 平衡盐溶液【PBS液的配制：可配成含0.85%NaCl，pH=7.2的PBS(简称PH=7.2 的PBS) PBS液(10×)贮存液配法:

NaCl8.5g,KCl0.2g,NaHPO4·12H2O2.85g(NaHPO4·2H2O 1.13g),K H2 PO4 0.27g溶与100ml三蒸水中。1mol/L（100×）HEPES贮存液配法：取23.8gHEPES溶于100ml三蒸水中,用1 mol/LNaOH调pH至7.5～8.0后,过滤除菌,分装(2ml/瓶),4℃或-20℃保存。】

9、 2%NaOH 1%HCL。

器材与设备：可调微量移液器（5-40μl、40-200μl、200-1000μl）（共用）及对应枪头；铝制或不锈钢制盒子；针头式滤器（0.22μm的微孔滤膜）4个；100ml输液瓶10个；细胞培养瓶10个；50 ml刻度离心管：10个；刻度吸管5 m1、 10 m1各10个；尖头吸管10个（带小胶头）；显微镜一台；水平离心机一台；吸管筒：3个；细胞计数板一个；脱脂棉（酒精棉球）。

材料来源：柠檬酸钠抗凝脐血；

实验方法

（一）Ficoll—Hypaque分离法

257

1、将Ficoll—Hypaque溶液小心地加于刻度离心管底部，体积不超过试管的1／4。

2、取抗凝血若干毫升，用Hanks液（或PH=7.2 的PBS）将其稀释1倍，混匀。用刻度吸管将稀释血液沿管壁轻轻加于Ficoll—Hypaque上面，使稀释血液重叠于Ficoll—Hypaque溶液上。稀释血与Ficoll—Hypaque液的柱高之比约为3：2，且两者的总柱高不超过试管的2／3。（15/22.5）。

3、将试管置水平离心机中，以2000r／min离心20min。离心毕，试管内可见分为五层，一般可分为4个组分：最上层是血浆和血小板；第二层是单核细胞和淋巴细胞；第三层为Ficoll—Hypaque；第四层为粒细胞；第五层是红细胞。收集第二层细胞于离心管内。

4、将收集的目的细胞悬液进一步用适量Hanks液（或PH=7.2 的PBS）1000rpm离心5min洗涤，弃上清，将沉淀弹起，用适量D-MEM/F-12培养液将各管内细胞收集在一管内。（若红细胞较多，可用三蒸水解离红细胞，解离后加Hanks液（或PH=7.2 的PBS）离心、弃上清用适量D-MEM/F-12培养液悬浮）。

5、 检查细胞活力,计数并计算细胞密度：取2滴细胞悬液加l滴2％台盼蓝染液，混匀，5min后，取样作湿 片检查。活细胞不着色，死亡细胞呈蓝色。取用台盼蓝染过的细胞悬液用HANKs液（或PH=7.2 的PBS）稀释一定倍数，混匀后吸取1 滴，加至细胞计数板内，按白细胞计数法计数4个大方格内的细胞数，以下式计算细胞悬液中的细胞密度(个／m1)： 细胞密度＝4大格细胞总数除以4乘以l0乘以稀释倍数(个／m1)

（二）细胞培养所用培养基配方及培养方法

D-MEM＼F-12（1∶1） 100ml ；谷氨酰胺 30mg；BFGF 2μg；EGF 2μg；青霉素 100001U；链霉素 10000?g。

根据分离出的细胞的密度，算出将细胞配成2×10个/ ml的培养液的量，取该量的D-MEM＼F-12将细胞稀释，再根据该量算出所需谷氨酰胺、 青霉素/链霉素贮存液的量并加入其中，37℃、5%CO2进行细胞培养。每二天更换一次培养液。

258 6 4

实验十一 血细胞的分离和红细胞的融合

实验材料

实验试剂：

1. PH=7.2 的PBS

2. 0.4％台盼蓝染液,

3. 50％聚乙二醇(PEG) 称取一定量的PEG(MW＝4000)放入刻度试管，在酒精灯下或沸水中加热溶化。待冷至50℃时，加入等体积并预热至50℃的GKN液混匀。

4.GKN液 NaCl 8g，KCl 0．4g，Na 2HP04·2H20 1．77g，NaH2PO4·2H2O 0．69g，葡萄糖2g，酚红0．01g，溶于1000ml三蒸水中。

器材与设备：刻度离心管5 ml：吸管；细胞计数板一个；显微镜一台；水平离心机两台等。

待分离材料：柠檬酸钠抗凝血。

实验内容

1、将淋巴细胞分离液加入离心管2ml。

2、取抗凝血2毫升，用PH=7.2 的PBS 0.5ml将其稀释倍，混匀。用刻度吸管将稀释血液沿管壁轻轻加于淋巴细胞分离液上，使稀释血液重叠于溶液上。

3、将试管置离心机中，以2000r／min离心20min。

4、离心毕，试管内可见分为五层，一般可分为4个组分：最上层是血浆，包括PH=7.2 的PBS，含部分血小板；第二层为云雾状的白膜层，主要含单个核细胞(包括淋巴细胞和单核／巨噬细胞)，还混杂有少量血小板；第三层为梯度介质层，如果离心速度和时间掌握得好，此层不应含细胞；第四层为粒细胞，紧贴红细胞上呈一层很薄的白膜。第五层即沉淀于管底的红细胞。

5、 用刻度吸管收集第二层即单个核细胞(包括淋巴细胞和单核／巨噬细胞)层，用适量PH=7.2 的PBS稀释细胞悬液1500rpm离心10min洗涤，弃上清，重复两次，用适量培养液将细胞悬浮。

6、 检查细胞活力,计数并计算细胞密度。

7、取第五层红细胞，加入PBS液， 1500rPm离心5min。重复三次，最后一次离 259

心10min。

8、在沉降血球中加入GKN液，使之成为10％的悬液。

9、取上述溶液一滴，用血球计数板计数，加GKN液稀释至每立方毫米含红细胞3～4万个。

10、取上述溶液1m1，加入0．5m150％的PEG液，迅速混匀，常温下2—3min滴片镜捡。

观察时注意不同程度的融合现象*通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连，②细胞膜形成穿孔；②两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。

11、计算融合率；

融合率＝融合细胞核数/总细胞核数×100%

附录:

一、 普通染色观察

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min，10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。

（一）HE染色法

1.染液配制

(1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。

(2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸

260

馏水即成工作液。

2.染色程序

（1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。

（2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。

（3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。

（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。

（5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。

（6）入伊红染液30s～1 min。

（7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次)各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。

（8）用二甲苯透明2次，各5min。

（9）树胶封固。

3.染色结果

细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。

（二）吉姆萨染色法

此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。

1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制

（1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。

（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。

（3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。

261

2.染色程序

（1）将标本用甲醇固定5～10min。

（2）入吉姆萨液染色10～15min。可用染色缸；或将染液滴覆于标本。

（3）蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。

3.染色结果

细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。

二、 玻片处理方法

对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。

1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。

2、用自来水冲洗5min。

3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。

4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。

5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。

6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。

三、培养物的常用固定方法

固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。

1.固定组织、细胞的基本原则

尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方 262

法。

2.培养物的准备和固定前处理

各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。

3.常用固定液

常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。

(1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精和其他合成染料染色。

甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。

(2)丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮(4℃)固定细胞内酶效果较佳。

(3)乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的适宜浓度为70％～100％。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。

(4)醋酸：常用0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨胀作用显著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合，所以，常用醋酸来减少其他固定剂引起的 263

细胞收缩。细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好地保存染色体，还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。

(5)苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水中的溶解度可因水温变化而变化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。它和其他药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬化，而且易于染色。所以在很多混合固定液中被广泛采用。作固定用的最适浓度为1％。

(6)锇酸(四氧化锇)：锇酸是一种强氧化剂，不能同乙醇和甲醛混合使用。它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特别注意。四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中盛入50～100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.4)，再将装有1g锇酸的安培瓶放人PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用。常用的固定液浓度为1％～2％。

(7)戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原。常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1。

表14-1 常用的戊二醛固定液配制方法

Ph7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液（ml） 96

25%戊二醛水溶液（ml）

戊二醛的终浓度 4 1% 96 6 1.5% 92 8 2% 90 10 2.5% 88 12 3%

(8)甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形态不变。不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于Giemsa染色(注意：此固定液宜现用现配)。

(9)FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞，固定效果好。 配制方法：90ml 80％酒精中加5ml冰乙酸和5m140％甲醛。

(10)Carnoy固定液：Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液，是显示细胞化学成分(如粘多糖等)时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，适于固定培养的单层细胞。配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。

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(11)Bouin固定液：用于固定双盖片法培养的标本，固定30分钟后，用70％酒精褪去苦味酸黄色，如不立即染色，可将标本保存在70％酒精中。本试剂适于固定组织细胞的糖原。

配制方法：先将75ml饱和苦味酸(100ml水中加1.2～1.4g)过滤，加入25ml福尔马林(40％甲醛，有沉淀时禁用)，最后加入5ml冰醋酸，混和后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。该固定液对组织细胞穿透力较强，固定效果较好，保存的细胞结构完好。但因偏酸(pH为3～3.5)，对抗原有一定损害。

(12)4％多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，在50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛，加热至60～70℃时，边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH，至液体清晰透明。用1mol/LHCl调节pH至7.4，冷却后加入0.01mol/LPBS液至100ml，4℃保存。本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白。

主要参考文献

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6.张卓然主编，实用细胞培养技术.北京：人民卫生出版社，1999

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